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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and resp iratory syndrom e,PRRS)是以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为特征的传染病,PRRSV是该病的病原体。将PRRSV CH-1a株ORF6基因疏水性较强的区域删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达了M r约为37 000的融合蛋白rtM,W estern b lot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtM,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtM作为包被抗原,通过间接EL ISA方法筛选阳性克隆,结果获得了1株能稳定分泌抗rtM蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为M 2B3。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的单克隆抗体能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体M 2B3为IgG 1型,其轻链均为κ链。研究获得的融合蛋白rtM及单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析M蛋白的抗原表位等提供有益帮助。 相似文献
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高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
白细胞介素—10(IL-10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,用RT—PCR扩增了猪IL-10(poIL—10)编码基因,克隆并测序验证后,将其亚克隆到表达载体pPROEX^TM HTb中,转化DH5α后,用IPTG诱导培养,经免疫印迹和生物活性检测显示,重组菌株表达了具有活性的重组poIL—10,重组poIL-10表达水平达3mg/ml培养液,占菌体细胞总蛋白的30.2%,本研究为poIL-10的功能研究和临床应用奠定了基础。 相似文献
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猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备 总被引:3,自引:3,他引:0
从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不断发生变异,其防控难度也逐渐增加。为了及时监测PRRSV在自然感染背景下的遗传进化特点,本研究从上海某发病猪场的临床样品中分离获得1株PRRSV毒株,命名为SHpd1/2018株,并对其生物学特性和基因组序列进行分析。结果表明,该毒株基因组全长为15 018 bp(不含poly A),不能被针对HP-PRRSV强毒HuN4株的Nsp2的单抗所识别,但其增殖特性与强毒HuN4株相似。序列分析表明,SHpd1/2018株与HP-PRRSV强毒株的相似性最高(与HuN4相似性为94.3%)。重组分析结果显示,SHpd1/2018株是以HP-PRRSV-like为主要亲本毒株,NADC30-like为次要亲本毒株的重组病毒,两个重组断点nt 2002和nt 3205均位于Nsp2基因的高变区。研究证实SHpd1/2018株是1株发生变异重组的PRRSV分离株,该毒株是上海某猪场保育猪发病的主要原因。 相似文献
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为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV)毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。 相似文献
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本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。 相似文献
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牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析 总被引:2,自引:0,他引:2
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的,主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病。该病对畜牧业危害巨大,欧美等国家已经开始实施BVDV根除计划。该病在中国广泛流行,本文就BVDV在中国的流行状况进行分析和概述。 相似文献
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猪流感是生猪养殖的国家普遍都会遇到的猪的呼吸道病[1]。虽然HI检测已经被作为可信赖的抗流感病毒抗体的检测方法[2]。但是,应用ELISA方法检测抗体具有明显的优势,对于待检血清不需要进行任何处理,而且也不必要对应用的抗原进行更换与选择[3]。试验采用的包被抗原为重组NP蛋白,较之以往的以全病毒作为抗原包被的诊断方法在工艺上要更为简化[4],且由于NP蛋白的高度保守性[5],因此可以直接判定是否有抗猪流感病毒的抗体,而不必仅对某亚型抗流感病毒抗体进行单项检测。本研究分别对使用酶标板的变异系数、抗原最佳工作浓度、HRP-兔抗猪I… 相似文献
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猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NSl基因的克隆与原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪 相似文献
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为了探讨通用型辅助性T细胞表位对猪瘟病毒人工合成短肽抗原免疫原性的影响,本研究合成了含有猪瘟病毒E2蛋白线性中和表位的短肽B,合成了含有通用型辅助性T细胞表位的短肽Th-B。同时,为了探讨免疫刺激基序对人工合成短肽抗原免疫原性的影响,合成了含有免疫刺激序列的IS-Th-B。将上述3种合成肽与弗氏佐剂混合乳化后,免疫兔子,比较3种不同的抗原肽诱导的抗体水平,并用猪瘟弱毒对免疫兔子进行攻击,比较抗原肽的免疫保护效果。结果显示,Th-B和IS-Th-B诱导了相当的抗体水平,但显著高于抗原肽B诱导的抗体水平。Th-B和IS-Th-B免疫延迟但没有阻止兔定型热的产生,而抗原肽B免疫兔和未免疫兔一样发生了明显的定型热反应。本研究表明,免疫刺激基序对本研究中的短肽诱导的抗体应答没有产生明显影响,但通用型辅助性T细胞表位增强了短肽抗原的免疫原性。 相似文献