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为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。 相似文献
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表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸菌口服免疫小鼠特异性免疫应答分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产生规律;在加强免疫后流式细胞仪检测分析外周血T细胞的变化情况及无菌收集免疫鼠的肠黏液,经中和试验检测其抗体的中和能力。结果表明重组菌株口服免疫小鼠后血清中的IgG和IgA抗体产生能力由于非特异性干扰不能确定,外周血中T细胞百分数在实验组和对照组间变化不显著;粪便中的IgA抗体水平产生效果明显;黏液的抗体具有一定的中和能力,其效价检测结果为1:36。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答 总被引：2，自引：0，他引：2
以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组质粒pHN为模板，Li-15和Li-2为上、下游引物扩增出TGEVTH98／N基因。将N基因与真核表达载体pcDNA3．1( )分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后连接，构建了重组真核表达载体pcDNA—N。将昆明鼠随机分为2组，分别肌肉注射pcDNA—N和pcDNA3．1( )，每只鼠100μg，共免疫3次，每次间隔2周。首次免疫后第0、14、21、28、35、39、47和54d采血分离血清，采用ELISA检测抗体动态变化。注射pcDNA—N组小鼠在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。 相似文献
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旨在分析表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作为饲用微生态制剂对仔猪促生长与抵抗猪霍乱沙门菌感染的作用。将该重组菌连续饲喂28日龄断乳仔猪21 d,并设立空菌组、对照组以及抗生素组。第21天时对断乳仔猪连续口服感染猪霍乱沙门菌3 d,并设置7 d的观察期;仔猪感染后采集试验组与对照组血清、肠黏液及肠组织。检测结果显示重组菌组仔猪平均日增重与免疫器官指数均显著提高（P<0.05）,料重比极显著降低（P<0.01）。感染猪霍乱沙门菌后,相对于对照组,重组菌组仔猪日增重提高,腹泻率降低;重组菌组仔猪血液中IgG以及肠黏液中IL-4、sIgA的量极显著提高（P<0.01）,IL-2、IL-12、IL-6的量显著降低（P<0.05）;重组菌组仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的基因转录水平和TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平极显著提高（P<0.01）,仔猪肠道内猪霍乱沙门菌的数量极显著降低（P<0.01）;重组菌组与抗生素组无明显差异（P>0.05）。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高断乳仔猪的生长性能、促进肠道形态发育、增强肠道屏障功能,并且在一定程度上可以保护仔猪免受猪霍乱沙门菌的感染,表明重组菌作为微生态制剂替代断乳仔猪的饲用抗生素具有一定的应用前景。 相似文献
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为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl2浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×108 CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×107 CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×108 CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×106 CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。 相似文献
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双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV 总被引：1，自引：0，他引：1
用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。 相似文献
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为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。 相似文献
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为了在大肠杆菌中表达支气管败血波氏杆菌prn基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR方法以败血波氏杆菌的基因组DNA为模板扩增prn基因,插入到pMD18-T克隆载体进行测序,并将目的基因插入原核表达载体pPro-HTa中,构建重组质粒pPro-HTa-prn,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因,并用SDS-PAGE和Western-blot检测该蛋白。结果表明:成功构建了重组质粒pPro-HTa-prn,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了prn基因;重组蛋白纯化前后均可与支气管败血波氏杆菌阳性血清发生特异性反应。说明支气管败血波氏杆菌prn基因获得成功表达,重组蛋白具有与天然蛋白一样的抗原特异性。 相似文献
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旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板，在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增，本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物，优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)反应体系，检测了反应的特异性和敏感性，确定了反应的最佳温度和时间，通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL-1,且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述，通过对RPA反应条件的摸索与优化，成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法，两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性，对... 相似文献
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为构建以木糖为选择标记的乳酸杆菌表达载体,根据GenBank登录的E.coli JM109 xylA和xylB基因序列设计引物,以E.coli JM109基因组为模板,扩增xylAB基因,与人工合成的多克隆位点序列MCS基因、去除氯霉素基因的乳酸菌载体质粒pPG2片段及以pPG2载体质粒为模板扩增的repA基因连接,电击转化于L.casei 393感受态细胞,获得以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并命名为pOXM2。为鉴定pOXM2载体表达蛋白的效果,以含猪细小病毒VP2基因的重组质粒pMD-VP2为模板,扩增VP2基因序列,与载体质粒pOXM2连接,产物电击转化L.casei393感受态细胞,获得阳性克隆子pOXM2-VP2。重组菌经诱导,并进行SDS-PAGE及western blot分析。结果表明,有约180ku重组蛋白得到了表达,而且表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白一样的免疫反应特异性。本研究结果表明已成功构建了以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并实现了外源基因的表达,为进一步研究以重组干酪乳杆菌作为口服疫苗或表达功能性蛋白奠定了基础。 相似文献