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1.
为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20 min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。 相似文献
2.
为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2021,(8)
为建立可用于临床检测猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,本研究根据App apxIVA基因3'末端保守区,设计CRISPR/Cas12a特异性gRNA,在gRNA序列与靶序列结合位点的上下游区域内,利用Primer Premier 5.0设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,利用RPA引物扩增靶基因apxIVA,通过gRNA识别特异性靶基因序列,激活Cas12a蛋白单链DNA酶的切割活性,根据免疫层析试纸条检测原理设计单链DNA报告分子,使用免疫层析试纸条检测体系内报告分子是否被切割进而实现对靶基因的检测。并通过各反应条件的优化建立了一种针对APP的检测方法。反应条件优化结果显示,最佳单链DNA报告分子浓度及gRNA浓度分别为500 nmol/L、100 nmol/L;最佳孵育缓冲液为10%聚乙二醇,最佳反应时间为30 min。该方法仅对App的检测为阳性,而对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示该方法对App重组质粒标准品的检测下限可达10拷贝/μL,比普通PCR方法敏感性高1 000倍;重复性试验结果显示,该方法对3个不同稀释度重组质粒标准品的批内和批间重复性试验检测结果均一致,重复性较好。对40份小鼠的肺脏病料样品进行检测,结果显示本研究建立的方法检出27份阳性样品,且通过试纸条即可直接观察结果。常规PCR方法检出25份阳性样品,二者的符合率为95%。本研究所建立的方法具有操作简单、快捷、结果直观,无需昂贵设备等优点,为现地快速检测该病原提供了一种切实可行的技术手段。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2018,(12)
为建立一种简便、快捷的现地检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的方法,本研究联合重组酶聚合酶扩增(RPA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RPA上、下游引物的5'端分别进行异硫氰酸荧光素和生物素标记,通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ILTV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在30℃～42.5℃恒温反应20 min即可实现对ILTV目的基因片段的有效扩增;与其它常见禽病病原DNA无交叉反应;RPA扩增产物直接用胶体金侧向流免疫层析试纸条肉眼观察,最低检测限为100拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。结果表明,本研究建立的RPA-LFD检测方法灵敏度高,操作方便,可用于ILTV的临床快速检测。 相似文献
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塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。 相似文献
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猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1) 为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒，是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础，旨在建立靶向FHV-1 TK基因的RPA-Cas12a-LFD快速可视化检测方法。根据FHV-1 TK基因的保守片段序列设计RPA引物和合成crRNA的引物，并通过反应体系验证、RPA-Cas12a-LFD检测灵敏度和特异性分析，以及临床样本的符合检测，评价FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法的有效性。结果显示，建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法可以特异性地检出FHV-1(与其他猫相关病原无交叉反应)，灵敏度极高(最低检测限为2.35×10-1 copies·μL-1)，检测时间短，结果可视化。该方法对20份表现明显症状的患猫呼吸道样本的FHV-1检出率(35%，7/20)高于现有的TB Green qPCR方法(25%，5/20)，对其中5份阳性样本的检测符合率为100%。综上表明，成功建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD检测方法的特异性好和敏感性极高，不需要特殊的检测设备，可以作为FHV-1现场快速检测的有效工具。 相似文献
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为建立能同时检测牛诺瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)的重组酶辅助扩增-侧流层析试纸条(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)快速检测方法。本试验按照RAA引物探针设计原则,分别针对BNoV RdRp基因和BRV VP7基因的保守区设计引物和探针,制备标准重组质粒,建立并优化RAA-LFD反应体系,同时对该检测方法进行特异性、敏感性及重复性评估,用建立的RAA-LFD法与PCR法、qPCR法分别对采集的168份腹泻犊牛的临床样本进行平行检测。结果显示,该方法可在20 min, 39℃的条件下扩增目标片段,对BNoV和BRV敏感度均为103 copies·μL-1,与PCR的检测结果基本一致,且与牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infecti... 相似文献
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(1):41-45
为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。 相似文献
12.
本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。 相似文献
13.
根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus) 3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法.反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93％.利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1 pg.利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3％,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高. 相似文献
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为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为102、102、103、103 TCID50/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为101、102、102、102<... 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(4)
猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是导致猪肠道疾病的重要病原之一,可引起猪呕吐、严重腹泻和脱水等症状,新生仔猪表现出较高的死亡率。PDCoV常与其他肠道病毒混合感染猪群,给养猪业带来严重的经济损失。因此,快速、高效和特异的检测技术是有效防控PDCoV的关键环节。论文主要对当前国内外应用的PDCoV病原学检测技术进行总结,包括病毒分离培养鉴定、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和基因芯片技术等,并分别介绍了各方法的优缺点,以期为PDCoV的快速诊断方法的研发和疫病的有效防控提供参考。 相似文献
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通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查. 相似文献
17.
【目的】建立一种基于量子点(quantum dots, QDs)技术的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)gB抗体免疫层析试纸,为PRV疫苗免疫效果评估提供一种快速、简便的检测技术。【方法】选用昆虫细胞表达系统表达的gB蛋白,采用羧基修饰的水溶性QDs,在偶联剂1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下制备gB-QDs荧光标记物。将金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus protein A,SPA)和抗gB蛋白的单克隆抗体分别固定在硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,将样品垫、标记垫、吸水垫、支撑底板按生产工艺组装成基于QDs的荧光免疫层析试纸。检测该试纸的特异性、敏感性及与商品化ELISA试剂盒的符合率。【结果】敏感性试验结果显示,该试纸的敏感性为1∶6 400。特异性试验结果显示,该试纸与猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清均无交叉反应,特异性为100%。通过检测田间猪血清样品,对比商品化ELISA检测试剂盒,结果显示,113... 相似文献
18.
旨在利用6-羧基荧光素(6-FAM)与6-FAM单克隆抗体、生物素与链霉亲和素之间的特异性结合，制备可用于nfo酶切割探针的重组酶聚合酶(RPA)反应产物结果可视化的胶体金侧向免疫层析试纸条(GICS)。通过杂交瘤法和诱生腹水法制备了高亲和力的6-FAM单克隆抗体(亲和力常数为5.38×109 L/mol),再运用高浓度NaCl破坏试验，确定了胶体金与6-FAM抗体的最佳标记pH值为8.0,最佳抗体标记量为12μg/mL,并使用模拟样本确定了最佳检测(T)线包被缓冲液为0.2 mol/L(pH值5.0)。然后使用RPA nfo反应产物作为实际样本，观察条带的深浅，最终确定在层析液为0.1 mol/L PB(pH值7.4)、T线包被1 mg/mL SA、反应液用量5μL及金标抗体用量10μL条件下，能实现试纸条最佳检测性能。自主研发的胶体金侧向免疫层析试纸条在加样5 min后能出现清晰的条带，与目前商品化试纸条的可视化判定结果一致，能替代现有的商品化试纸条，降低检测成本、缩短检测时间，对建立RPA nfo-GICS及RPA-CRISPR Cas12a-GICS检测方... 相似文献
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旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为基础的快速检测方法,用于小鹅瘟病毒的快速检测。小鹅瘟是一种常见的水禽传染病,严重危害我国养鹅业的健康发展。为了快速准确对小鹅瘟进行诊断,减少该病的危害,本研究以小鹅瘟病毒VP3基因保守片段为靶点,利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）建立了一种准确高效的小鹅瘟病毒RPA恒温快速检测方法,并对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统PCR和传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,该检测方法具有较高的灵敏度,可检测到10 copies/μL的病毒核酸;具有良好的特异性,只特异性地扩增鹅细小病毒,而与鹅副黏病毒、鹅源鸭瘟病毒、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病毒、大肠杆菌和曲霉菌均未发生交叉反应;同时该方法重复性检测的变异系数低于6%,具有很好的重复性。阳性符合试验表明该检测方法与荧光定量PCR符合率为99%。该方法可以很好地应用于小鹅瘟的大规模临床样本检测,为小鹅瘟病毒的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。 相似文献