仔猪水肿病病原菌的分离鉴定     

曹永国  刘育华  蔺涛  李文良  黄秦  曹瑞兵 《中国畜牧兽医》2008,35(11):111-114

从江苏淮安某猪场具有典型水肿病临床症状和剖检变化的发病猪组织分离的菌株中挑选5株大肠杆菌,分别命名为JS0001、JS0002、JS0003、JS0004和JS0005。通过培养特性、菌体形态、染色特性、生化鉴定及血清学试验等一系列方法对其进行系统鉴定,并对这5株细菌进行抗药性、溶血性、Vero细胞毒性和小白鼠致病性等试验。试验结果表明,JS0001、JS0002、JS0004和JS0005表现β型溶血,腹腔接种小白鼠,JS0001、JS0002、JS0003、JS0004对其具有较高致病性;5株细菌药敏特性基本一致：对痢特灵（FR）、头孢噻肟（CTX）、阿米卡星（AN）敏感,对头孢曲松（CRO）敏感性最高,而对阿莫西林(AMX)、多西环素(DO)等药物具有耐药性。JS0002、JS0004能够分泌Vero细胞毒素,确定为产类志贺毒素大肠杆菌（SLTEC）。血清学试验结果表明,JS0002、JS0004的血清型为O₁₃₉,JS0001、JS0003为O₁₄₁。  相似文献   

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达     

王秀青  张素芳  曹瑞兵  周斌  陈溥言 《农村．农业．农民》2007,(3):120-123

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.  相似文献   

猪IL-10的表达及其免疫原性鉴定     

李倬  郑其升  陈瑾  侯红岩  薛刚  侯继波 《江苏农业学报》2012,(1):92-98

为探明原核表达的重组猪IL-10对仔猪的免疫原性,根据GenBank公布的猪IL-10基因序列(登录号:L20001)设计并合成了扩增猪IL-10基因的引物。利用ConA刺激猪外周血淋巴细胞,通过RT-PCR扩增出pmIL-10完整基因及其成熟蛋白基因片段(pmIL-10),分别插入质粒pVAX1和pET32α(+),对猪IL-10基因进行原核与真核表达。利用纯化的重组蛋白免疫仔猪,制备抗血清,利用间接ELISA检测血清效价。将pVAX-pIL-10转染COS-7细胞,利用RT-PCR检测pmIL-10的转录,以间接免疫荧光(IFA)鉴定其与原核表达产物制备抗体之间的反应。结果显示:该试验成功获得了猪IL-10基因,重组菌pET-pmIL-10/Rosetta经IPTG诱导后,猪IL-10获得表达,目的蛋白表达量以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39.7%;以白油佐剂重组蛋白免疫仔猪可产生高水平的抗猪IL-10的抗体,经ELISA检测,P/N值可达到8,OD630吸光值可达1.875,该抗体与转染pVAX-pmIL-10的COS-7细胞发生明显的荧光反应,说明原核表达的重组猪IL-10免疫产生的抗体具有生物学活性,为日后利用猪IL-10抗体消除病毒感染中产生的内源性IL-10研究奠定了基础。  相似文献   

稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立     

赵凯  冯磊  郑其升  侯继波  陈溥言 《江苏农业学报》2012,28(3):565-570

以RT-PCR方法从原代猪肺泡巨噬细胞中获得CD163 cDNA序列,然后测序鉴定,对突变碱基进行修正,将修正后碱基序列克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,构建重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163,通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。使用脂质体2000将pcDNA4.0-CD163转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),通过Zeocin抗性筛选,建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系。RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)检测结果表明CD163在mRNA和蛋白质水平均已表达。通过Zeocin抗性筛选,共获得8株表达CD163的重组细胞株,IFA检测结果表明表达的CD163定位于重组细胞的细胞膜表面。去除筛选抗性后连续传代10代,间接免疫荧光检测结果确定重组细胞株在10代内性状稳定,说明稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系构建成功。  相似文献   

Ⅰ型鸭肝炎病毒概述   总被引：4，自引：0，他引：4  

范卫国  杜佳慧  曹瑞兵  陈溥言 《动物医学进展》2009,30(11):110-114

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种高度致死性、高度传播性的传染病.DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用.Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,对养鸭业危害严重,造成了巨大的经济损失.论文从Ⅰ型鸭肝炎病毒的病原特点、分类地位、分离培养、基因组结构和功能以及病毒的诊断与防控等方面,介绍了DHV-Ⅰ的研究概况.  相似文献   

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定     

李斐郑其升  李学仁魏繁华  于春梅李鹏 陈溥言 《农业生物技术学报》2006,14(6)

  相似文献   

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在毕赤酵母中的表达          下载免费PDF全文

徐学清  曹瑞兵  蔡梅红 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2005,33(3):11-15

对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。  相似文献   

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定   总被引：22，自引：1，他引：22  

曹瑞兵  周斌  陈德胜  陈溥言 《南京农业大学学报》2003,26(2):71-75

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。  相似文献   

重组E2蛋白-乳胶凝集试验检测猪瘟病毒血清抗体     

郑其升  苏小运  周斌  曹瑞兵  张晓勇  李鹏  陈溥言 《农业生物技术学报》2005,13(3):331-334

人工合成4条两两互补的DNA序列,经磷酸化和退火后与经BglⅡ酶切的pET-E2载体连接,得到pET-E2HA重组质粒.该质粒除表达E2蛋白A/D抗原区外,还表达3个串联的人流感病毒(Human influeoza virus)血凝素表位.重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用IPTG诱导表达.利用纯化后的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断猪瘟抗体水平的乳胶凝集试验.利用盐酸胍溶解包涵体并过His·Bind柱,获得纯化的重组蛋白.研究结果表明,乳胶凝集方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于猪瘟病毒(Classical swinefever virus,CSFV)血清抗体检测的新方法.  相似文献   

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

王秀青  张素芳  曹瑞兵  周斌  陈溥言 《南京农业大学学报》2007,30(3):120-123

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.  相似文献