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应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
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甲醛是广泛应用的病毒灭活剂,但其缺点也很明显,如刺激性强、破坏免疫原性、灭活不彻底等,因此需要寻找一种可以替代传统灭活剂甲醛的新型灭活剂。通过细胞盲传三代、无菌检验和台盼蓝染色等方法,结合不同灭活浓度与灭活时间双因素来筛选聚维酮碘与甲醛灭活牛传染性鼻气管炎病毒的最优条件,同时,向MDBK细胞中接种不同浓度的聚维酮碘和甲醛观察是否对MDBK细胞具有毒性和刺激性。结果表明10%的聚维酮碘24 h时可彻底灭活传染性鼻气管炎病毒,0.3%的甲醛48 h时可彻底灭活牛传染性鼻气管炎病毒,0.5%的甲醛对细胞具有强烈刺激导致绝大多数细胞死亡,而浓度为15%的聚维酮碘对MDBK细胞仍无刺激,直到浓度高达20%时才对细胞有了较大刺激,说明聚维酮碘无刺激性和毒性、安全性更高。为病毒灭活疫苗的理想灭活剂提供了新的方向,并为新型灭活剂的研发奠定基础。 相似文献
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近期部分规模化猪场猪伪狂犬病野毒抗体监测情况调查 总被引：4，自引：1，他引：4
猪伪狂犬病仍然是我国猪群的重要威胁性传染病，通常造成母猪繁殖障碍以及仔猪的神经症状和高死亡率，同时伪狂犬病病毒也是猪呼吸系统疾病综合征的重要原发性病原。用gE-ELISA野毒鉴别诊断方法共检测了来自8个省、市46个猪场1940份血清样品，其中阳性样品657份，样品总阳性率33.87%，阳性猪场25个。在检测的各场中，阳性率最高猪场达到75.76%(125/165)。而部分进行了科学的疫苗免疫和实施了严格的生物安全措施的猪场始终保持猪伪狂犬病阴性(0/135)。利用基因缺失疫苗科学免疫配合伪狂犬抗体鉴别诊断技术是控制和净化伪狂犬病的重要手段。 相似文献
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黄酮是桑黄的重要活性成分,具有多种药理作用。在对料液比、提取温度、提取时间3个因素进行单因素试验的基础上,应用响应面法对桑黄黄酮的超声波辅助乙醇回流提取工艺进行优化,并测定其还原力及对DPPH自由基、羟基自由基的清除作用。结果显示,桑黄黄酮提取的最优工艺条件为料液比1∶40、提取温度100℃、提取时间5 h,在此最优工艺条件下的桑黄黄酮提取得率为4.41%,达到回归模型预测值的98.44%;3个因素对桑黄黄酮提取得率的影响从大到小依次为提取温度、提取时间、料液比,并且料液比与提取时间之间存在交互作用;提取的桑黄黄酮具有较强还原力以及对DPPH自由基和羟基自由基的强清除作用,表现出明显的体外抗氧化作用。 相似文献
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为了解牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）的S基因变异情况并建立ELISA检测方法,本研究对采自不同牛场的新生犊牛腹泻（CD）和成年牛冬痢（WD）腹泻样本提取总RNA,反转录合成cDNA,利用PCR扩增S全基因和S1基因。将S1基因目的片段连接表达载体pET-32a （+）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达。结果显示,CD与WD分离株S基因核苷酸为98.4%,CD和WD分离株与参考毒株BCoV-ENT株核苷酸同源性最高,分别为98.4%和98.5%,CD分离株与参考毒株SUN5株的同源性最低,为97.5%,WD分离株与FRA/EPI/Caen/2003/13同源性最低,为97.3%。通过比对可知,分离株与已知毒株之间存在较大差异,为疫苗候选毒株筛选提供依据。本试验同时构建了pET-32a-S1表达载体,在0.2 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组菌能在大肠杆菌BL21感受态细胞中产生大量的S1融合蛋白,获得约58 ku表达产物。本试验成功表达了S1蛋白,并对BCoV进行了核苷酸进化分析,为疫苗免疫效果评价方法的建立奠定了基础。 相似文献
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为筛选出检测猪支原体更为特异、敏感的PCR检测方法,本试验分别以16S rRNA、50S rRNA和膜蛋白OxaA为靶基因进行PCR检测,并从其敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以膜蛋白OxaA和16S rRNA为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为1.86 fg/μL,而以50S rRNA为靶基因的PCR方法最小检测DNA量为18.6 fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出大肠杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、牛附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;通过对临床60份血液样本的检测结果表明,以膜蛋白OxaA基因设计的引物检出率最高,为25%(15/60),明显高于16S rRNA基因的21.6%(13/60)和50S rRNA基因的18.3%(11/60)。本试验为猪支原体病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。 相似文献
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对于复杂几何外形的离心泵，在层推进法生成混合三棱柱/四面体网格时，很难生成高质量的贴体三棱柱网格，且层推进法生成三棱柱时可能违背流形的可视化条件，针对这一问题，本文在层推进法的基础上，采用一种新的层推进矢量计算方法生成三棱柱网格，并对影响整体网格质量的棱柱层数及棱柱层之间的比例系数进行研究，同时对生成的网格进行数值模拟，并与已有算法生成的网格的数值计算结果及实验结果进行对比，结果表明，三棱柱层数越少，网格质量越高；比例系数越小，网格质量越高，但比例系数减小会使网格数增加，因此，基于计算精度和计算效率考虑，推荐层数为3，比例系数为1。通过对比不同算法生成的混合网格结果表明，在网格数量基本相同情况下，本文算法质量高于已有算法，且计算精度更高。 相似文献
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根据发表的犬新孢子虫MAG1基因序列(EF580924.1)和Bov IFN-γ基因序列(M29867.1)设计2对引物.分别以犬新孢子虫基因组DNA和pET28α-IFN-γ重组质粒为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)将犬新孢子虫MAG1基因与IFN-γ基因拼接,构建pMD18-T MAG1-IFN γ克隆质粒和pGEX-4T-MAG1-IFN-γ重组表达质粒,将鉴定正确的pGEX-4T-MAG1-IFN-γ重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物.结果表明,SOE PCR扩增获得双基因融合片段大小为1 491 bp,与GenBank中发表的MAG1 (EF580924.1)和IFN-γ(M29867.1)核苷酸序列的同源性为99％；MAG1-IFN-γ融合基因表达蛋白大小为82 000,具有较好的反应原性. 相似文献