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131.
本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别,并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、p GEX-4T-1、p ET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白,利用镍-氨三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA)亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白,并用间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示,p Cold-TF载体以表达可溶性蛋白为主,pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白,而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示,可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白(P<0.05)。p Cold-TF载体的触发因子(trigger factor, TF)标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达,其表达蛋白的免... 相似文献
132.
为制备禽传染性支气管炎病毒(IBV) S2蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化重组S2蛋白,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到4株能够稳定分泌S2蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4F12、4A7、4D1。亚类鉴定结果显示4株MAb的重链均为Ig G1,轻链均为κ。采用间接ELISA法检测上清及腹水效价,结果显示MAb细胞上清效价均不低于1∶12 800,腹水效价均不低于1∶51 200。采用western blot检测制备的S2蛋白MAb与IBV感染鸡胚尿囊液后天然表达的S2蛋白的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero)后天然表达的S2蛋白的反应原性。Western blot结果显示,感染IBV的鸡胚尿囊液中出现了90 ku左右的特异性条带;IFA结果显示,感染IBV的Vero细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的S2蛋白MAb能够与天然表达的S2蛋白反应,反应原性较强。利用间接ELISA检测MAb与S2蛋白的亲和力,结果显示4株MAb对S2蛋白均有良好的亲和力。利用一系列表达部分重叠的重... 相似文献
133.
为制备猫冠状病毒(feline coronavirus, FCoV)核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长c DNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting, WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定。结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×106,与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV... 相似文献