宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响     

王璐  朱顺海  赵其平  黄兵  韩红玉  刘桂玲  李志行  赵焕之  董辉 《畜牧兽医学报》2019,(10)

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。  相似文献   

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析     

李洋  韩红玉  董辉  赵其平  姜连连  朱顺海  郭涛  平宪卿  马卫娇  曾艳波  程军  黄兵 《中国预防兽医学报》2010,32(5)

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。  相似文献   

中国家畜家禽球虫种类概述   总被引：14，自引：0，他引：14  

黄兵  董辉  沈杰  韩红玉  赵其平 《中国预防兽医学报》2004,26(4):313-316

球虫是严重危害畜禽生长的一类重要寄生性原虫,隶属于艾美耳科(Eimeriidae)的4个属,即艾美耳属(Eimeria)、等孢属(Isospora.)、泰泽属(Tyzzeria)、温扬属(Wenyonella),具有显著的宿主特异性.了解我国畜禽球虫种类,对做好球虫病防治工作具有指导意义.作者通过对我国近50年的畜禽球虫调查资料进行整理、汇总,列出了发现于我国马、骆驼、牛(黄牛、水牛、奶牛、牦牛)、羊(绵羊、山羊)、猪、犬、猫、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑的球虫136种,其中艾美耳球虫117种、等孢球虫9种、泰泽球虫6种、温扬球虫4种.按宿主分别为马的球虫1种,为艾美耳球虫;骆驼的球虫8种,为艾美耳球虫;牛的球虫16种,为艾美耳球虫;羊的球虫28种,为艾美耳球虫;猪的球虫16种,其中艾美耳球虫14种、等孢球虫2种;犬的球虫3种,为等孢球虫;猫的球虫2种,为等孢球虫;兔的球虫17种,其中艾美耳球虫16种、等孢球虫1种;鸡的球虫9种,为艾美耳球虫;鸭的球虫20种,其中艾美耳球虫11种、等孢球虫1种、泰泽球虫4种、温扬球虫4种;鹅的球虫11种,其中艾美耳球虫9种、泰泽球虫2种;鸽的球虫2种,为艾美耳球虫;鹌鹑的球虫3种,为艾美耳球虫.  相似文献   

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因   总被引：5，自引：0，他引：5  

韩红玉  姜连连  赵其平  董辉  陈兆国  林矫矫  黄兵 《中国兽医学报》2006,26(4):369-372

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。  相似文献   

上海地区奶牛场球虫感染现状调查     

赵其平  韩红玉  王赞江  董辉  姜连连  王鑫  韩静芳  黄兵  袁耀明 《畜牧与兽医》2007,39(11):43-46

为了解上海地区规模化奶牛场奶牛感染球虫的情况,我们对上海地区17个牧场的奶牛球虫感染状况进行了随机抽样调查,分别于2005年10月和2006年4月按不同年龄阶段共采集粪样316份。调查结果显示:17个牧场都有球虫感染,1个牧场的感染率最高达70%,其中10月份调查的感染率为36.45%,4月份调查的感染率为40.05%,两者没有明显的差异;从不同年龄阶段奶牛的感染情况来看,发现感染率最高的2个阶段为0~2月龄和4~6月龄,感染率高达为45%,感染率最低的年龄阶段为12月龄以上的奶牛,感染率为25%;从感染强度来看,上海地区牧场奶牛的球虫感染强度大部分平均OPG低于1000,占58.82%,只有一个牧场的平均OPG比较高,为14250;从本次调查结果发现有6种艾美耳球虫(Eimeria),分别是牛艾美耳球虫(E.bovis)、椭圆艾美耳球虫(E.ellipsoidallis)、邱氏艾美耳球虫(E.zurnii)、怀俄艾美耳球虫(E.wyomingensis)、柱状艾美耳球虫(E.cylindrica)、亚球形艾美耳球虫(E.subspherica),优势虫种为牛艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、椭圆艾美耳球虫,其他3种球虫所占比例较少。  相似文献   

三种药物防治奶牛球虫病试验     

赵其平  姜连连  韩红玉  王赞江  董辉  黄兵  王鑫  韩静芳  袁耀明 《中国兽医寄生虫病》2007,15(3):15-17

目的为考察现有抗球虫药物对奶牛球虫病的防治效果。方法选用应用较广的3种抗球虫药物(地克珠利、拉沙里菌素、莫能菌素)对1~6月龄球虫感染阳性奶牛进行防治试验。将34头球虫感染阳性奶牛分为4组,地克珠利组9头,按体重0.5 mg/kg.BW每天口服1次;拉沙里菌素组9头,按360 mg/头每天口服1次;莫能菌素组8头,按1 mg/kg.BW每天口服1次;不用药物对照组8头。连续用药10d,停药后再观测10 d,每3 d直肠采集粪便检测球虫1次,以每克粪便球虫卵囊数(OGP)为试验指标。结果用药9 d后的OPG与用药前相比,地克珠利组下降了78.9%,拉沙里菌素组下降了80.92%,莫能菌素组下降了98.81%。停药3~6 d后,地克珠利和拉沙里菌素组的OPG上升较快,而莫能菌素组的OPG保持较低水平。结论3种抗球虫药对奶牛球虫病均有防治效果,其中莫能菌素最好,拉沙里菌素和地克珠利次之。  相似文献   

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验     

黄兵  赵其平 《中国兽医杂志》1995,21(3):24-25

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...  相似文献   

柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析     

孔春林  韩红玉  姜连连  王晔  董辉  赵其平  朱顺海  李婷  薛璞  舒凡帆  黄兵 《中国动物传染病学报》2012,(2):47-52

在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。  相似文献   

一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白单抗的制备及初步应用     

平宪卿  韩红玉  姜连连  赵其平  董辉  黄兵  岳城  李洋  郭涛  朱顺海 《中国兽医寄生虫病》2010,18(2):47-51

利用原核表达的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白（EtRP）的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经4次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA和Western blot筛选获得一株抗EtRP蛋白的特异性单克隆抗体细胞株，命名为2E3，亚类鉴定为IgG2a。细胞上清和小鼠腹水的效价分别为1：40和1：2．56×10^4。利用该单抗对EtRP在柔嫩艾关耳球虫子孢子中的分布进行分子定位，结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端；而当子孢子在DMEM培养基中41℃孵育1h后，该蛋白则分布于整个虫体。研究结果表明，成功制备了EtRP单克隆抗体，为进一步研究球虫相关蛋白功能奠定了基础。  相似文献   

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建     

平宪卿  韩红玉  黄兵  姜连连  董辉  赵其平  李洋  郭涛  朱顺海 《西南大学学报(自然科学版)》2011,33(6)

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.  相似文献