猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救     

朱元源  韩焘  邹兴启  范学政  徐璐  王琴  赵启祖 《中国农业科学》2013,46(1):187-194

【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建,PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应,且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合,因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。  相似文献   

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验 替代方法的研究与应用   总被引：4，自引：1，他引：3  

陈锴  姚华伟  王长江  徐璐  范学政  赵启祖  邹兴启  朱元源  赵燕  杨光友  王琴 《中国农业科学》2013,46(1):162-169

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。  相似文献   

猪瘟病毒抗体ELISA检测国家级能力验证结果与分析     

徐璐  夏应菊  张乾义  张雯雯  王震  李翠  邹兴启  朱元源  徐嫄  王兆  赵启祖  王琴 《畜牧兽医学报》2020,51(9):2250-2256

猪瘟疫苗免疫是我国猪瘟防控的核心，猪瘟病毒抗体ELISA检测是进行免疫效果评价的最常用手段。中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室（以下简称：参考实验室）承担了国家认证认可监督管理委员会（以下简称“认监委”）组织的A类能力验证项目“猪瘟诊断检测技术”（CNCA-19-A01），全面考察和评价我国动物疫病检测机构对猪瘟病毒抗体的检测能力。参考实验室负责制备检测样品，并进行随机编号。向每个参试实验室发放4份待检盲样，由其采用ELISA方法对各盲样进行定性判断，并向参考实验室提供检验结果及原始检验报告。出现“不满意”结果的单位可参加补测1次，若补测结果仍为“不满意”，则表明该实验室暂不具备该参数的检测能力。参加本次能力验证猪瘟病毒抗体检测的实验室共有103家，初测满意率为92.23%，初测和补测的总体满意率为100%。此次能力验证结果表明，参加此次能力比对试验的猪瘟检测机构均能够提供正确的检测结果，可以满足猪瘟病毒抗体监测的需求。通过本次能力验证项目查找出了存在的问题，参试单位可以及时纠正错误，进一步提升猪瘟抗体的检测能力。  相似文献   

猪瘟病毒3′非编码区的多态性及其二级结构分析     

范运峰  赵启祖  赵耘  邹兴启  张仲秋  王琴  宁宜宝 《中国农业科学》2010,43(4):828-834

【目的】分析CSFV3′-UTR一级序列和二级结构,为研究其对病毒复制、增殖和毒力的关系奠定良好的基础。【方法】利用RT-PCR技术扩增CSFV Thiverval株、HCLV株和Shimen株的3′-UTR并测序,使用DNAstar、Sequencher和RNAstructure软件进行CSFV3′-UTR基因组序列的比对分析和二级结构模拟。【结果】Thiverval株3′-UTR最长可达259个碱基,与母源株Alfort相比,含有32nt的插入,最短只有233个碱基,含有6nt的插入。HCLV株最长有244个碱基,含有17nt的插入;最短有233个碱基,含有8nt的插入。同时,疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型和自由能发生改变,自由能随着插入片段的增加而升高。【结论】(1)CSFV3′-UTR存在两个高度变异的区域。(2)CSFV疫苗株Thiverval株和HCLV株3′-UTR同一样品不同克隆株中插入片段呈现明显的不均一。(3)疫苗株的插入片段影响3′-UTR二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。  相似文献   

非洲猪瘟紧急预防控制技术需求   总被引：4，自引：0，他引：4  

赵启祖  王琴 《中国兽药杂志》2018,52(10):1-4

非洲猪瘟是原发于非洲肯尼亚的猪的一种重要病毒性传染病,2018年8月3日首次发生于我国沈阳。该病来势凶猛,截至10月16日,已在我国9个省份引发39次疫情。我国非常重视非洲猪瘟防控工作,具备了较好的科技储备,但疫情形势发展超乎预期,出现许多始料未及的情况,仍需要重新梳理防控技术需求,针对性地开展防控技术研究。就此,简要介绍了非洲猪瘟的特性,归纳了我国目前非洲猪瘟防控技术需求,建议深入开展快速特异诊断技术、流行病学、病原学等急需技术研究,开展野猪和软蜱传播媒介与非洲猪瘟流行关系和非洲猪瘟免疫与疫苗等基础研究。  相似文献   

应用高效体积排阻色谱法测定市场抽检口蹄疫灭活疫苗中的抗原（146S）含量     

徐嫄  邹兴启  刘晓东  李翠  朱元源  李阳  万建青  何天慈  徐璐  张乾义  王琴  郑金来  赵启祖 《中国兽药杂志》2018,52(1):7-13

应用高效体积排阻色谱法对5批市场抽检口蹄疫灭活疫苗中有效抗原(146S)含量进行检测,并使用口蹄疫O型、A型和亚洲1型抗原测试卡对5批疫苗中的抗原进行鉴别。结果显示高效体积排阻色谱法测定146S标准品浓度与峰面积线性关系良好,5批疫苗均检测到146S特征吸收峰(R2=0.9937,n=7),经计算得到灭活疫苗中有效抗原含量分别为2.05、3.73、2.03、4.87、3.41μg/m L;使用抗原测试卡鉴别了5批疫苗中的抗原类型。结果表明,高效体积排阻色谱法简便、高效,准确度较高,有望在口蹄疫灭活疫苗的质量控制中发挥重要作用。  相似文献   

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化   总被引：1，自引：1，他引：0  

徐璐  范学政  徐和敏  赵启祖  邹兴启  朱元源  王琴  宁宜宝  王芳 《中国兽医杂志》2012,48(3):15-17,97

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。  相似文献   

WHO国际生物制品标准物质制备指导原则介绍与我国兽用生物制品标准物质制备程序思考     

李翠  王兆  万建青  徐嫄  邹兴启  朱元源  赵启祖 《中国兽药杂志》2020,54(5):72-77

介绍了WHO 2004年公布的最新的国际及其他生物制品标准物质制备、鉴定和建立的指导原则,旨在引进科学的、具有指导性意义的国际生物制品标准物质建立程序和技术标准,为我国兽用生物制品标准物质制备程序的建立提供依据。  相似文献   

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术     

胡庭俊  赵启祖 《甘肃农业大学学报》1996,31(2):100-101

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。  相似文献   

口蹄疫病毒强毒株China/99 P2区核苷酸序列测定及比较分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

张显升  赵启祖  刘在新  江鹏斐  常惠芸  陈应理  李冬  魏怀录  谢庆阁 《畜牧兽医学报》2002,33(5):496-500

以口蹄疫病毒强毒株China/99PNA为反转录模板，用一对特异性引物扩增目的cDNA，然后与pGEM-T Easy载体连接并转化J109菌株，再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定，序列测定和分析结果表明，该强毒株与A12、O1K和TW45毒株的核苷酸差异率分别为7．78％、6．62％ 13．19％，推导的氨基酸序列差异率分别为1．23％、1．84％和5．73％，4个毒株序列比较发现，China/99、O1K和TW45三毒株的2A／2B连接处为甘氨酸／脯氨酸，A12为精氨酸／脯氨酸，而且T－C转换率和A－G转换率较高，是点突变的热点核苷酸，氨基酸差异主要存在于2B和2C蛋白中，2A基因较为保守，2B蛋白和第1－4，63－67，73－78，83－91，116－121和126－131区域，2A蛋白的第4－9区域和2C蛋白的第9－13，22－25，91－96，150－159，179－188，201－207和258－262区域可能是重要的活性中心。  相似文献