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RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。 相似文献
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采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。 相似文献
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介绍了巴拉圭2011年疫病暴发的过程、处理措施及后果,分析了发生的可能原因,建议政府应进一步控制疫苗生产过程,确保疫苗质量,警惕人为因素导致该病发生。 相似文献
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反向遗传操作技术的问世为RNA病毒的研究铺平了道路,研究人员根据需要在DNA水平上对RNA病毒进行加工和修饰,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在猪瘟病毒上应用以来,在对猪瘟病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因等方面的研究已取得明显进展。本文就反向遗传操作技术在猪瘟病毒基础理论研究中的应用作一综述,通过了解病毒基因组的功能、病毒与宿主致病力的关系以及病毒增殖特性等,为研究开发理想猪瘟标记疫苗开拓思路。 相似文献
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【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建,PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应,且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合,因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。 相似文献
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荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验 替代方法的研究与应用 总被引：4，自引：1，他引：3
【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应（不合格）样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应（合格品）样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。 相似文献
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猪瘟疫苗免疫是我国猪瘟防控的核心，猪瘟病毒抗体ELISA检测是进行免疫效果评价的最常用手段。中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室（以下简称：参考实验室）承担了国家认证认可监督管理委员会（以下简称“认监委”）组织的A类能力验证项目“猪瘟诊断检测技术”（CNCA-19-A01），全面考察和评价我国动物疫病检测机构对猪瘟病毒抗体的检测能力。参考实验室负责制备检测样品，并进行随机编号。向每个参试实验室发放4份待检盲样，由其采用ELISA方法对各盲样进行定性判断，并向参考实验室提供检验结果及原始检验报告。出现“不满意”结果的单位可参加补测1次，若补测结果仍为“不满意”，则表明该实验室暂不具备该参数的检测能力。参加本次能力验证猪瘟病毒抗体检测的实验室共有103家，初测满意率为92.23%，初测和补测的总体满意率为100%。此次能力验证结果表明，参加此次能力比对试验的猪瘟检测机构均能够提供正确的检测结果，可以满足猪瘟病毒抗体监测的需求。通过本次能力验证项目查找出了存在的问题，参试单位可以及时纠正错误，进一步提升猪瘟抗体的检测能力。 相似文献
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应用高效体积排阻色谱法对5批市场抽检口蹄疫灭活疫苗中有效抗原(146S)含量进行检测,并使用口蹄疫O型、A型和亚洲1型抗原测试卡对5批疫苗中的抗原进行鉴别。结果显示高效体积排阻色谱法测定146S标准品浓度与峰面积线性关系良好,5批疫苗均检测到146S特征吸收峰(R2=0.9937,n=7),经计算得到灭活疫苗中有效抗原含量分别为2.05、3.73、2.03、4.87、3.41μg/m L;使用抗原测试卡鉴别了5批疫苗中的抗原类型。结果表明,高效体积排阻色谱法简便、高效,准确度较高,有望在口蹄疫灭活疫苗的质量控制中发挥重要作用。 相似文献