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本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10~(2.63) TCID_(50)/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H_2O_2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2~(-9)标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 相似文献
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不同方法对鸡胚和法氏囊中囊病病毒抗原含量的检测比较 总被引:5,自引:1,他引:4
用单抗介导的抗原捕获-酶联免疫吸附试验(AC-ELISA),琼脂扩散试验(ACP)快速诊断试纸条(ISK)对感染同株强毒或弱毒囊病病毒(IBDV)的鸡胚和鸡法氏囊中的病毒抗原效价进行了检测比较,结果表明,上述3种方法测得法氏囊中温毒IBDV抗原效价分别为10^6.0(AC-ELISA),2^-3.0(AGP)t 10^-3.0,测得鸡胚中强毒IBDV抗原效价依次为10^-1.0,0和0。强毒株接种鸡胚后,只有第1代鸡胚组织可被AC-ELISA测到低效价的IBDV抗原,而第2代以后则未能测到病毒抗原,弱毒疫苗株IBDV感染鸡后,法氏囊中可测到低效价抗原,但感染鸡胚后则无可测性病毒抗原。 相似文献
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中国猪繁殖与呼吸综合征病毒流行历史及现状 总被引:1,自引:1,他引:0
猪繁殖与呼吸综合征是当今世界危害养猪业的非常重要的疫病之一。我国自1995年首次报道本病以来,至今已流行20余年。本文从分子流行病学的角度系统分析我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行历史及现状,希望为PRRSV的防控提供新的视角和参考。当前美洲型(genotype 2)和欧洲型(genotype 1)PRRSV在我国均有流行,基于ORF5基因的序列分析显示,我国美洲型流行毒株分属于lineage 8、lineage 5、lineage 3和lineage 1四个谱系,且当前以lineage 8(highly pathogenic PRRSVlike)和lineage 1(NADC30-like)为主。我国早期毒株BJ-4与VR2332的全基因组相似性为99.6%,提示BJ-4可能为北美输入性毒株。我国欧洲型毒株均属于subtype 1,目前至少有9个省市检测到了欧洲型毒株的流行,与Lelystad virus毒株相比,我国流行毒株的GP5和N蛋白上均具有特有的保守氨基酸位点。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引:3,自引:1,他引:3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性,通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段,与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h,通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录;用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验,可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中,PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆,在表达量高的细胞中,细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白,表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献
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采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX - 6P- 1,转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导,SDS -PAGE分析表达了N端带有GST的融合蛋白,Western -blotting试验表明融合蛋白在变性条件下能和牛IgG结合。GST -FcγRⅠ融合蛋白的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。 相似文献
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鸡传染性法氏囊病单抗快速诊断试剂盒的研制及初步应用 总被引:1,自引:0,他引:1
以感染传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)的鸡法氏囊组织制备免疫抗原 ,免疫 BALB/c系小鼠 ,取其脾细胞与 NS0浆细胞进行细胞融合 ;以 AC-ELISA筛选阳性细胞克隆 ,经 3次有限稀释克隆化及鉴定 ,获得 2株识别 IBDV不同抗原决定簇的高亲和力单克隆抗体株。以该 2株单克隆抗体制备快速诊断试剂 ,组装了鸡传染性法氏囊病快速诊断试剂盒。该试剂盒由若干 4 0孔酶标板 ,1号酶标液 ( HRP标记 IBDV单抗 )、2号洗涤液、3号显色液 ( TMD显色底物 )、4号显色液 (供氢体 )等反应液 ,0 .0 1 mol/L PBS( p H7.2 )阴性对照、IBDV阳性对照 (提取的 IBDV蛋白 )组成 ,并对试剂盒特异性、敏感性、重复性及稳定性等进行了鉴定。应用该快速诊断试剂盒对来源于不同地区的临床诊断疑似 IBD的法氏囊病料各 2 0份进行了检测 ,并与琼扩试验、常规ELISA检测结果作了比较 ,结果表明 ,该快速诊断试剂盒的检测结果与常规 ELISA的检测结果相似 ,操作程序简便 ,可在 1 0~ 1 5min内完成 ,适合于兽医临床推广应用 相似文献
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本研究应用酸脱毛法 ,将供试工程菌培养物进行脱毛、提取制备表达蛋白 ,并对酸脱毛法的最适pH值、最佳温度、最佳时间进行了探讨 ,SDS_PAGE分析结果证明 ,酸脱毛法脱毛pH值为 2、脱毛温度为 6 0℃、脱毛时间为 30分钟时 ,表达蛋白分离提取的效果最佳。对提取蛋白进行琼扩 ,SDS_PAGE、Western_blot分析 ,结果表明所提取蛋白具有较高的抗原活性 ,并能被K88K99单克隆抗体所识别。 相似文献
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从郑州、信阳等地鸭场的发病或死亡鸭的脑、心血、肝、脾等脏器中分离到3株革兰氏阴性小杆菌(HP_1、HP_2、HP_3),经形态学检查、生化试验、血清学试验,三株分离菌被鉴定为Ⅰ型鸭疫巴氏杆菌.药敏试验表明,分离株对蒽诺沙星等抗菌药物都较敏感. 相似文献