河南省3种主要猪病的抗体检测     

张利平  郭育培  方先珍  闫若潜 《中国畜禽种业》2019,(8)

为了解河南省规模猪场、屠宰场及散养猪场猪瘟、猪蓝耳、口蹄疫这3种疫病的免疫情况,及时发现猪群潜在风险,为河南省重大动物疫病的预警防控提供理论参考依据,笔者对采集的1899份猪血清进行猪瘟、猪蓝耳、口蹄疫O型的免疫抗体检测,结果显示,猪瘟、猪蓝耳、口蹄疫O型的免疫抗体总体合格率分别为88.41%、 83.25%、 82.11%;其中规模猪场的免疫抗体合格率分别为88.72%、 83.56%、 83.12%;屠宰场的免疫抗体合格率分别为90.50%、 87.67%、 77.50%;散养猪场的免疫抗体合格率分别为82.99%、 72.92%、 88.19%,均达到了我国强制性免疫疫苗抗体阳性率(70%)的标准。  相似文献   

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用     

王淑娟  刘梅芬  闫若潜  班付国  赵雪丽  马震原  王华俊  王翠  赵明军 《中国畜牧兽医》2017,44(7):2112-2118

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。  相似文献   

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析     

马震原  李宁  闫若潜  班付国  王淑娟  赵雪丽  谢彩华  王东方  王华俊  曹伟伟 《中国畜牧兽医》2017,44(7):2086-2095

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。  相似文献   

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用     

赵雪丽  闫若潜  吴志明  曹伟伟  王淑娟  谢彩华  马震原  周兵强  王东方 《中国畜牧兽医》2015,42(4):865-870

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义.  相似文献   

重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体外活性评价方法研究     

杨晓璐  闫若潜  李勤楠  赵雪丽  谢彩华  刘梅芬  张书阳 《中国畜牧兽医》2015,42(12):3153-3159

为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2 ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在DF1细胞上抑制水疱性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖活性;采用MTS法分别测定重组融合蛋白促鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)和脾淋巴细胞增殖活性。结果表明,重组融合蛋白可以与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应;重组融合蛋白在DF1细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV活性高于抗IBDV活性,且均明显高于rChIFN-α蛋白对照;不同浓度的重组融合蛋白均具有明显的促鸡PBLC和脾淋巴细胞增殖活性,且其促增殖活性明显高于rChIFN-α蛋白对照。本研究成功建立了重组融合蛋白体外活性检测评价方法,为进一步探究重组融合蛋白在鸡体内协同作用奠定基础。  相似文献   

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究   总被引：1，自引：1，他引：0  

马文涛  闫若潜  吴志明  刘光辉  盛敏  谢彩华 《中国畜牧兽医》2011,38(11):102-105

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。  相似文献   

Mx蛋白研究进展   总被引：8，自引：2，他引：6  

闫若潜  吴文学  夏春  李新生 《动物医学进展》2004,25(6):52-55

Mx蛋白是干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一。人、哺乳动物、鱼类、家禽体内都有Mx蛋白。Mx蛋白具有GTP酶活性 ,在其肽链氨基端均包含一个氨基酸序列高度保守的的三联GTP结合区域 ,羧基端存在有亮氨酸拉链区域。人和鼠的Mx蛋白有抗病毒活性。家禽中鸭的Mx蛋白无抗病毒活性 ;鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受 6 31位氨基酸的影响 ,当 6 31位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性 ,为丝氨酸时则无抗病毒活性。文章最后对禽类Mx蛋白的应用和展望进行了探讨  相似文献   

猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

闫若潜  赵明军  张志凌  张健  盛敏  刘光辉  吴志明 《农业生物技术学报》2008,16(1):55-60

摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体（M.suis）推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒（pGEX-T/M.suis）为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）;对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示：标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。  相似文献   

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果   总被引：2，自引：2，他引：0  

贾松涛  闫若潜  崔保安  吴志明  张志凌  张健  赵雪丽 《农业生物技术学报》2008,16(5)

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2.  相似文献   

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用     

刘影  闫若潜  王东方  杨海波  赵美雪  宋丹  赵雪丽  谢彩华  王淑娟  马震原  柴茂  王翠  刘梅芬 《中国动物传染病学报》2024,(2):118-130

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^-1～10⁵ copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%～3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PR...  相似文献