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根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。 相似文献
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新城疫病毒HN蛋白球状头部在T4噬菌体衣壳表面的展示 总被引：1，自引：1，他引：0
用RT-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因，得到大小约1700bp的片段，将其克隆至pGEM-T easy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果，另设计1对引物带有EcoR I限制位点，用PCR扩增基因主要功能区即编码HN蛋白球状头部的hngd片段，将其分别克隆至pSOC和pR质粒soc基因3′端，重组质粒pSOC-HNGD转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞，以终浓度1mmol／L的1PTG诱导表达，在SDS-PAGE凝胶上检测到相对分子质量大小约67000的目的蛋白条带。随后将重组质粒pR-HNGD转化T4宿主菌E2感受态细胞．阳性克隆用溶菌酶缺陷的T4-Z1感染，用不加溶菌酶的SC平板筛选阳性克隆。经PCR鉴定，hngd片段已整合在T4-Z1的基因组中。纯化后的重组噬菌体T4-Z1-HNGD用SDS-PAGE和Western-blot可检测到67000的特异条带。结果表明，HNGD蛋白成功展示在T4噬菌体衣壳表面，且与NDV抗血清具有良好的反应性。 相似文献
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传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆及表达 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR技术扩增编码IBDV VP5基因的DNA片段，进而构建了T7启动子控制下的N端His-Tag融合表达质粒pRSESTA-VP5,通过测序证明序列正确后，转化进大肠杆菌ＢL２１（ＤＥ３），用ＩＰＴＧ进行诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明，融合蛋白（约28kDa)在BL21中得到高效表达，表达产物约占菌体蛋白的35％。主要以包涵体形式存在，通过金属离子（Ni2 )螯合亲和层析纯化，得到纯度在90％以上的电泳纯表达产物VP5。这些结果为进一步研究IBDV VP5的结构与功能、其在IBD中的作用机理奠定了良好的基础。 相似文献
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从具有猪圆环病毒病临床症状的猪体内分离到1株PCV2华南分离株,并进行了全基因组序列测定。序列分析发现PCV2ORF2的变异原因主要是点突变,但也存在连续突变和缺失/插入突变,而PCV2 ORF1的变异均为点突变,变异程度很小。将此PCV2华南分离株的全基因组序列与GenBank上收录的18个PCV2毒株的全基因组序列做进化树分析,表明此PCV2华南分离株与国内PCV2分离株、欧洲株更接近,而与韩国、中国台湾、日本和美洲毒株则稍远,在基因进化树上,无法判定基因分支与地理位置是否有相关性。 相似文献
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将口蹄疫病毒免疫串联片段FA克隆至原核表达载体pBAD/TOPO中,经鉴定后得到重组质粒pBAD-FA,将此重组质粒转化到受体菌TOP10中,用诱导剂阿拉伯醛糖分别以不同的浓度进行诱导,并在不同诱导时间进行采样,经处理后做SDS-PAGE、Westem blot分析.结果发现以终浓度为O.002%的阿拉伯醛糖进行诱导,4 h后表达可达到高峰,其大小约为23 kD,软件扫描结果显示,FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的29.3%,能与抗FMDV抗体发生特异性反应,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在.将融合蛋白的可溶性组分用50%Ni-NTA树脂过柱纯化并抽提融合蛋白的包涵体,经过洗涤后分别制成油乳剂疫苗,经皮下注射免疫豚鼠,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒.结果表明,用此融合蛋白可溶部分的纯化产物和包涵体免疫豚鼠能诱导产生高滴度的中和抗体,对病毒的攻击分别提供100%和75%的免疫保护. 相似文献
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采用含传染性法氏囊病病毒(HK46毒株)VP2基因的质粒FA-pAlter为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．3kb左右的VP2基因产物；用Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ酶切后纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，将其定向克隆到经Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ不完全酶切后的pcAMBIA3301质粒上，构建成VP2植物表达载体。以电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，并用PCR方法进行了鉴定，为下一步的植物转基因研究生产可食用疫苗打下了基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明，获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321bp，推导的Gal-4由63个氨基酸组成，其中N端20个氨基酸为信号肽，C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外，分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡（对照组）和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡（感染组）的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明，在检测的6个组织中，肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别，而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异，感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中，对照组的30个样品检测到26个阳性样品，而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中，对照组30个样品检测到19个阳性样品，而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中，Gal-4基因的诱导表达情况非常明显，对照组30个样品中仅有9个阳性，而感染组的30个样品中有21个阳性。 相似文献
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以重组质粒pGEM-3-1E为模板，扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）广东株3-1E基因（长度为529bp），将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中，构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母，甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测，表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。 相似文献
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将FMDV免疫活性串联片段FB的cDNA片段插入表达质粒pSOC的EcoR Ⅰ位点,获得重组质粒pSOC-FB.用pSOC-FB转化E.coli BL21（DE3）,获得表达FB蛋白的工程菌BL-SOC-FB.在1 μg/ml IPTG诱导之下,BL-SOC-FB表达了融合蛋白SOC-FB,其分子量为19 ku.SDS-PAGE检测表明,融合蛋白SOC-FB的最大表达量为细菌总量的24.5%.Western blot分析表明,大肠杆菌表达的SOC-FB能与FMDV阳性血清发生特异性反应. 相似文献
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以3株国内分离的O型口蹄疫病毒(FMDV)(分别命名F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计2对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的cD-NA片段,将3个cDNA片段分别克隆到pMD20-T Vector载体中进行序列测定,得到3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3个O型FMDV毒株VP1基因cDNA长度均为639 bp,编码213个氨基酸。3株O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%~94.2%之间,推导氨基酸序列同源性在97.2%~98.6%之间。与3个毒株同源性高的主要为香港和台湾的毒株。 相似文献