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以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础. 相似文献
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荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因克隆、原核表达及其抗菌活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT－PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180 bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS－PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BNBD12的成熟肽基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的21.4%;纯化的重组蛋白0.05 mg?mL-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果;扫描电镜观察发现重组蛋白作用后可引起病原菌内容物外泄而死亡。【结论】成功表达了荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素12,该重组蛋白既可作用于革兰氏阳性菌又可作用于革兰氏阴性菌,显示出较好的临床应用前景。 相似文献
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溶血毒素是一种胞外毒素,是金葡菌主要毒力因子之一.金葡菌人源菌株多数产α-溶血素,而从动物分离的菌株多产β-溶血素,但是引起奶牛乳腺炎的金葡菌中α、β型未见相关报道.试验根据GenBank公布的α和β溶血素序列,设计双重PCR引物,对在山东省内20多个规模化奶牛场乳腺炎病例中分离得到的金葡菌提取模板,检测奶牛乳腺炎金葡菌溶血素基因型,为研制奶牛乳腺炎金葡菌基因工程疫苗提供科学的依据.试验建立了双重PCR快速检测金葡菌溶血毒素分型的方法,此法特异性好,准确性高,检测快速,证实应用此法对奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素进行分型是可行的. 相似文献
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提取能产生CAMP反应的牛源无乳链球菌山东分离株的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到pMD18-T载体中.测序结果表明,扩增片断含有768 bp的ORF,可编码含255个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成相比, 第8位Tyr→Cys,第95位Pro→Ser,第126位Thr→Ala的3个氨基酸发生了点突变,同源性为98.4;.成功构建原核表达载体pET32a+/cfb,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为48 kD,表达量占菌体总蛋白的52.7;.这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件. 相似文献
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通过16S rDNA全序列的DNA同源性分析以及PCR-RFLP分析，对从山东某奶牛场送检的腹泻死亡的犊牛内脏中分离到的一株沙门氏菌进行了血清型鉴定，得到其系统发育树状图。系统发育树分析表明，该沙门氏菌菌株与GENEBANK上发表的27株沙门氏菌的16S rDNA同源性较高，为97-99％，该沙门氏菌菌株与鼠伤寒沙门氏菌LT2（Salmonella typhimurium LT2）的同源性最高，达到了99．7％，表明该沙门氏菌菌株为鼠伤寒沙门氏菌。 相似文献
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新分离牛轮状病毒及其血清型的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒，（CHLY）并以其感染的MA-104为试验材料，较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察，并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定，鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒，直径在60-70nm之间，病毒粒子由双层衣壳包裹，呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中，可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高，核苷酸同源性为98．9％，结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。 相似文献
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本研究建立了一种同时检测大肠杆菌和魏氏梭菌的二重PCR方法,根据兔肠致病性大肠杆菌(REPEC)的eae毒力基因和魏氏梭菌的α-toxin毒力基因的基因文库,设计了两对分别与eae基因和α-toxin基因互补的引物,用这两对引物对同一样品中的REPEC和魏氏梭菌模板进行二重PCR扩增。结果均得到了两条特异性大小与试验设计相符的833bp(REPEC)和324bp(魏氏梭菌)的扩增条带,而对其它3种病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该二重PCR技术能检出10cfu的REPEC,10cfu的魏氏梭菌。 相似文献
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对4个不同奶牛场20头产后健康状况良好的奶牛每头奶牛采样器采集子宫样品,通过细菌培养、分离、鉴定等常规方法,对其子宫内细菌的动态变化规律进行了研究,以探讨产后健康奶牛子宫内细菌的动态变化规律及不同奶牛场之间的比较差异.结果表明,本试验还对产后不同阶段所分离到的细菌的种类和数量进行了详细的比较分析,在产后第2天,子宫内呈污染状态,细菌数量迅速增加,四组试验的计数结果分别达到了8.34×105、2.15×105、1.90×105、2.97×105,此后细菌数量呈缓慢增长趋势,在产后第8天时子宫内细菌计数达到最高,四组试验技术结果的平均数分别为:4.25×107、4.01×107、3.95×107、3.05×107. 相似文献
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