口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测   总被引：7，自引：0，他引：7  

鲁会军  金宁一  韩松  郑敏  尹革芬  张洪勇  葛淑敏  金扩世 《中国预防兽医学报》2005,27(3):175-178

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达.  相似文献   

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达     

汪伟  孙文超  曹亮  易驰喆  郑敏  鲁会军  金宁一 《动物医学进展》2018,(7)

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。  相似文献   

猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立     

孙文超  汪伟  赵翠青  赵海洋  刘立明  孟娟  王茂鹏  陈征  曹亮  陆依婷  夏秀秀  孙迪菲  宋璟子  郑敏  鲁会军  金宁一 《中国兽医学报》2019,(3):393-396

为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。  相似文献   

基孔肯雅病毒E1基因重组腺病毒的构建、鉴定及稳定性     

张金勇  肖朋朋  孙文超  解长占  张萍  韩继成  南福龙  曹亮  温树波  田明尧  鲁会军  金宁一 《中国兽医学报》2018,(4):709-715

构建表达基孔肯雅病毒E1蛋白的重组腺病毒,鉴定该重组腺病毒,并对该重组腺病毒的稳定性进行研究。本研究通过构建重组腺病毒穿梭质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1,将质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,并通过Western blot与PCR方法鉴定E1基因表达的稳定性。PCR鉴定结果表明重组腺病毒可扩增1323bp大小的条带;经Western blot鉴定重组腺病毒可表达大小为52 000的E1蛋白。结果表明,重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1可以成功表达基孔肯雅病毒E1基因;提取第0,2,4,6,8,10,12,14,16代重组腺病毒基因组,经PCR鉴定证实重组腺病毒在16代内稳定性良好。成功构建出表达基孔肯雅病毒E1基因的重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,该病毒可以稳定表达,为研发基孔肯雅病毒疫苗奠定基础。  相似文献   

PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析     

张涵  解长占  张世亨  李卓昕  李成辉  赵冠宇  马彬尧  尹革芬  鲁会军  金宁一  李太元 《中国兽医学报》2018,(7)

从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为YN-LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征,根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物,对YN-LQ株全基因进行扩增及测序,将测序结果依次拼接获得YN-LQ株的全基因序列,并进行序列的比对分析。结果显示:PRRSV YN-LQ株基因组全长为15 320bp;将YN-LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析,发现YN-LQ株与JXA1的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99.0%,其氨基酸序列有15个位点发生了改变;GP5基因序列同源性为97.7%,其氨基酸序列有9个位点发生了改变;全基因的同源性为98.7%。证实该毒株为JXA1变异株,为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。  相似文献   

云南省思茅地区乙型脑炎病毒及黄热病毒的分子流行病学监测     

刘振江  金宁一  鲁会军  李国江  刘昊  岳云强  郭欢欢  周红宁  杨中华  谢辉 《中国动物检疫》2011,28(3):65-67,77

2009年至2010年,在云南省思茅地区普文镇、思茅区、震东乡、六顺乡、勐旺乡等地共采集17880只蚊子(分为91管),其中库蚊16500只(83管),按蚊1380只(8管)。采用RT-PCR方法,对91管蚊虫样本进行流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因片段扩增,回收阳性PCR产物,并进行测序和遗传进化分析。结果表明,思茅地区库蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为18.1%(15管/83管),黄热病毒检测阳性率为15.7%(13管/83管),思茅地区按蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为25%(2管/8管),黄热病毒检测阳性率为12.5%(1管/8管)。克隆的流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因与JEV和YFV参考株进行序列比对,与乙型脑炎病毒参考株同源性为88.3%～90.7%。监测结果显示,思茅地区蚊子JEV和YFV带毒率均较高,表明当地两种虫媒病毒病流行风险高。  相似文献   

RHDV在多种属动物体内分布及细胞免疫水平     

金明兰  侯继波  郑其升  鲁会军  刘春霞  南文龙  任静强  韩松  金宁一 《中国兽医学报》2013,33(5)

应用纯化兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV),接种小鼠、豚鼠、SPF鸡、仔猪4d后剖杀,分离组织,通过电镜观察、血凝试验(HA)、RT-PCR,进行体内分布检测;同时将上述动物进行3次免疫,三免后10d分离外周血淋巴细胞进行IFN-γ、IL-4、WST检测病毒刺激指数(SI)。结果显示,通过电镜观察未见到病毒粒子;HA检测结果为肝脏的HA价最高,而肺脏最低;RT-PCR未检测到目的基因;WST检测结果免疫组刺激指数高于对照组;免疫组的IFN-γ和IL-4检测数高对照组。结果表明,RHDV在多种属动物分布规律相同,均能产生细胞免疫反应,为下一步试验奠定基础。  相似文献   

乙型脑炎病毒分子生物学特性及检测方法研究进展     

张丹  金扩世  金宁一  鲁会军  刘昊 《中国动物检疫》2009,26(12):70-72

日本乙型脑炎是一种由乙脑病毒引起的人畜共患的病毒性传染病,人和多种动物都可感染。主要引起人的神经系统疾病,猪的繁殖障碍,对人类的健康有极大的威胁,对养殖业带来重大经济损失。本文对乙型脑炎病毒的基因组结构、结构蛋白、非结构蛋白的分子生物学特性和检测方法的研究进展进行了综述。  相似文献   

重组病毒环境安全试验     

金明兰  侯继波  鲁会军  马鸣潇  郑敏  计越  金宁一 《江苏农业科学》2012,40(11):227-229

为检测重组病毒的环境安全性,将构建的重组病毒免疫小鼠、豚鼠、仔猪、犊牛,通过PCR、中和抗体、病毒分离培养等方法,对接种动物饲养环境中的水、土壤及粪便进行基因检测和病毒分离培养;将重组病毒分别与粪便、土壤、水等比混合后分别置于37℃、4℃、-20℃下,研究其存活能力.结果表明:重组鸡痘病毒饲养环境中的水、土壤、粪便中未检测出病毒基因,重组鸡痘病毒在自然条件下存活时间短,免疫重组鸡痘病毒的动物不能将病毒传染给亲密接触的同居动物,不会污染环境和威胁人类健康.  相似文献   

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立     

孙文超  解长占  赵冠宇  曹亮  郑敏  曹慧慧  张红云  韦显凯  韩继成  温树波  肖朋朋  靖杰  张萍  鲁会军  金宁一 《动物医学进展》2017,38(5)

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。  相似文献