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研究旨在探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶(JHDM2A)对猪成纤维细胞诱导为多能干细胞效率的影响,并对其内在的分子机制进行探究。以猪成纤维细胞为材料,采用多西环素(DOX)诱导的慢病毒生产诱导多能干细胞(iPSCs)体系,在此基础上过表达JHDM2A,通过碱性磷酸酶染色和绘制诱导时间轴检测其对诱导效率的影响;普通PCR技术检测克隆的多能性;免疫荧光检测多能因子的蛋白表达;实时荧光定量PCR检测JHDM2A在形成克隆后以及克隆分化过程中对多能因子、组蛋白甲基化相关基因表达的影响。结果表明,JHDM2A过表达组细胞在第3天发生形态变化,第8天形成iPSCs克隆,相比于对照组分别提前了1和2 d。碱性磷酸酶染色结果显示,与对照组相比,JHDM2A过表达组克隆形态明显改善,染色着色更深,诱导效率提高8倍。普通PCR结果显示,JHDM2A过表达组iPSCs、对照组iPSCs以及猪成纤维细胞(PFF)均表达内源性Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog,且iPSCs的Oct4表达量高于PFF。免疫荧光结果显示,JHDM2A过表达组iPSCs表达Oct4、Sox2、Stat3、JHDM2A,弱表达SSEA1、SSEA4。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组和猪成纤维细胞相比,JHDM2A过表达组iPSCs的Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Oct4、Tcl1的表达显著升高(P<0.05),Tfcp2l1和Zfp57的表达显著降低(P<0.05);JHDM2A过表达组P5代iPSCs培养基去除DOX后,随着代数的增加,Sox2、Nanog的表达逐渐降低,Klf4、c-Myc的表达先升高后降低,Oct4、Tcl1、Tfcp2l1、Zfp57的表达先降低后升高。以上结果表明,过表达JHDM2A通过促进组蛋白去甲基化提高猪成纤维细胞的诱导效率。 相似文献
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试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞(iPSC)。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10~6TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。 相似文献
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[目的]优化枯草芽孢杆菌CK15的发酵条件,提高其芽孢产量。[方法]通过单因素试验优化碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、无机盐种类、装液量、摇床转速、初始p H、温度、接种量,采用Plackett-Burman试验筛选出培养基中的显著因素,再利用Box-Behnken试验确定3个因素的最佳浓度。[结果]在玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO_3 7.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO_4 0.4 g/L、KH_2PO_4 1.0 g/L、装液量50 m L/250 m L、转速为200 r/min、初始p H 7.2、温度30℃、接种量2.0%条件下,芽孢产量达到7.4×109cfu/m L,比优化前提高了80.49%。[结论]响应面法有效提高了枯草芽孢杆菌CK15的芽孢产量。 相似文献
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本研究旨在通过对意大利水牛精液品质分析、睾丸周径测量、精浆中的氧化应激水平检测和精子活力相关基因表达情况来探究影响精液质量的相关因素。试验检测了6头意大利水牛精液的活力、畸形率、采精量,并在测量其阴囊周径后进行相关性分析;检测了意大利水牛精浆中氧化应激水平指标（丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px））并进行了相关性分析;分析了意大利水牛精子β-微管蛋白-2c（TUBB2C）、外周致密纤维2（ODF2）、筑丝蛋白2（TEKT2）、筑丝蛋白4（TEKT4）基因的表达定量及相关性。结果显示,意大利水牛阴囊周径与精液产量、活力、畸形率之间相关系数分别为0.423（P>0.05）、0.750（P<0.01）、-0.827（P<0.01）,即阴囊周径与精子活力呈显著正相关关系、与畸形率呈显著负相关关系;意大利水牛精子活力与MDA、T-SOD、GSH-Px指标之间相关系数分别为-0.522（P<0.05）、0.333（P>0.05）、0.474（P<0.05）,即精子活力与MDA含量之间存在显著负相关关系,与GSH-Px活性之间存在显著正相关关系,与T-SOD活性相关性不显著;意大利水牛精子活力与TUBB2C、ODF2、TEKT2、TEKT4基因指标之间相关系数分别为0.930（P<0.01）、0.726（P<0.01）、0.924（P<0.01）、0.839（P<0.01）,即精子活力与以上基因表达量存在显著正相关关系。本研究结果为了解影响意大利水牛精液质量的因素提供参考,也为意大利种公水牛的筛选提供理论依据。 相似文献
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桑椹胚致密化是早期胚胎发育过程中的关键步骤,与胚胎质量密切相关。已有研究发现体内外发育的胚胎表现明显不同的致密化过程,缝隙连接蛋白、上皮钙调素蛋白基因的表达也有差异。本文针对致密化相关基因在胚胎早期发育过程中的作用及一些影响因素的研究进展进行综述。 相似文献
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为了探讨抑制脂多糖结合蛋白(LBP)基因表达对水牛单核巨噬细胞在内毒素(LPS)诱导下炎症相关基因的表达,首先采用三质粒慢病毒包装系统包装LBP基因shRNA重组质粒pSicoR-GFP-shLBP774.利用病毒颗粒感染水牛单核巨噬细胞,进行荧光定量qRT-PCR及ELISA检测.结果显示,单核巨噬细胞在用5×108 IU/mL滴度的LBP-shRNA774慢病毒颗粒,感染指数(MOI)为300、感染7d的条件下,感染效率超过50%.qRT-PCR检测结果显示,与LPS对照组相比,shLBP774感染组可极显著抑制LBP基因的表达(p0.01),CD14,TLR4,TNF-α,IL-1β,IL-8等基因表达显著降低(p0.05).ELISA检测结果发现,与对照组相比,细胞分泌的TNF-α,IL-1β蛋白量显著降低(p0.05).以上结果表明,抑制LBP基因表达可以有效降低LPS诱导下单核巨噬细胞炎症相关基因的表达,进而调控LPS引发的炎症反应,提示可将LBP作为靶基因深入研究水牛单核巨噬细胞免疫功能和LPS致炎信号传导分子机制. 相似文献