副猪嗜血杆菌部分16S rRNA基因的克隆及序列分析     

冼琼珍  黄耿森  顾万军  黄良宗  王淑敏 《黑龙江畜牧兽医》2007,(2):72-73

副猪嗜血杆菌(Haenophilus parasuis,Hps)为副猪嗜血杆菌病的病原体。目前,副猪嗜血杆菌地方分离株基因背景研究国内报道不多,试验针对临床分离的2株Hps进行16S rRNA基因片段的扩增、克隆、测序及同源性比较,以期在分子水平对副猪嗜血杆菌进行鉴定。1材料与方法1.1菌种和质粒副  相似文献   

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的优化建立及初步应用     

曾强  陈响坤  顾万军  黄良宗  白挨泉 《黑龙江畜牧兽医》2010,(4)

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2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析     

陈盛楠  张海龙  谢博  黄良宗  顾万军 《动物医学进展》2020,(1):50-56

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。  相似文献   

猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析     

黄良宗  颜广智  邓汝森  陈盛楠  张海龙  顾万军 《中国畜牧兽医》2020,47(8):2625-2633

本研究从广东省某猪场采集37份疑似猪流感症状的猪鼻拭子样品,接种于9日龄SPF鸡胚并收集尿囊液,通过血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,分离得到一株猪流感病毒,经RT-PCR分别扩增8个基因片段,进行基因测序及序列分析,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树。结果显示,分离毒株为H1N1亚型猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/2/2018（H1N1）。遗传进化分析显示,分离株8个片段的核酸序列与A/swine/Guangdong/L3/2009（H1N1）对应序列的同源性均达99%以上,与经典型H1N1亚型猪流感病毒处于同一分支。分离毒株HA的裂解位点为PSIQSR↓GL,符合低致病性流感病毒分子特征。HA基因受体位点为190D、225G和226Q,表明本毒株既可以结合SAα-2,6-Gal型人类流感病毒SA受体,也有结合SAα-2,3-Gal型禽类流感病毒SA受体的可能,在28、40、104、304、498、557位氨基酸处有6个潜在糖基化位点;NA蛋白在50、58、63、68、98、146、235位氨基酸处有6个潜在糖基化位点,NA蛋白氨基酸序列活性中心位点为119E、199D、223I、275H、293R、295N,氨基酸分析位点未出现突变,表明本分离株对神经氨酸酶抑制剂类药物的敏感性较高,但在M2蛋白中,31位氨基酸由敏感型的（S）突变为抗药的（N）,提示可能对金刚烷胺类药物产生耐药性。开展猪流感病毒分离鉴定与遗传进化分析将为广东地区的猪流感流行和变异情况提供重要信息。  相似文献   

不同动物源大肠杆菌的耐药性调查     

贺丹丹  黄良宗  陈孝杰  杨铜  饶丽丽  罗东妹  陈佩玲  彭辉  刘健华 《中国畜牧兽医》2013,40(10):211-215

为了解畜禽源大肠杆菌的耐药状况,2011—2012年从患病和健康食品动物中分离鉴定大肠杆菌935株,包括健康猪源606株、患病猪源114株、患病鸡源51株、患病水禽源(鸭和鹅)164株。试验采用琼脂稀释法测定了不同动物来源的大肠杆菌对15种抗菌药物的敏感性。结果发现,大肠杆菌耐药严重,对大部分药物的耐药率超过70.0%,其中氨苄西林、复方新诺明和四环素的耐药率均达到了80.0%以上;仅对头孢西丁、黏菌素和阿米卡星较敏感,但患病水禽源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率达到了52.4%,明显高于其他动物。健康畜禽源大肠杆菌对多数抗菌药的耐药率低于患病畜禽源大肠杆菌,表明抗菌药物的使用增加了病原菌对第3代头孢类药物和氟喹诺酮类药物的耐药率,势必增加临床治疗难度。  相似文献   

中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响   总被引：1，自引：0，他引：1  

李丹  向华  黄良宗  娄华  柴家前  顾万军 《广东农业科学》2009,(5):140-144

采用细胞培养的方法测定了黄芪、板蓝根等6种中药在细胞安全浓度范围内抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用.试验结果表明,药物的最大无毒作用浓度为黄芪12.5 mg/mL、板蓝根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125mg/mL、鱼腥草1.526 mg/mL、青蒿1.526 mg/mL.先加药物后加病毒时,6种中药的保护作用均显著;先加病毒后加药物时,鱼腥草的作用比较稳定,而板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL保护率较高;药物与病毒孵育后加药,板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL的作用比较明显.  相似文献   

NDV地方分离株与La Sota株抗原交叉性研究     

黄良宗  麦根沛  王淑敏  冼琼珍  顾万军  陈建红 《动物医学进展》2006,27(3):96-98

用新城疫弱毒疫苗株La Sota阳性血清测定NDVMM,NDVLD,NDV-NH3株新城疫病毒地方分离株和标准株La Sota,F48E9的HI效价,以La Sota阳性血清对La Sota疫苗株的HI效价为参照,分析NDV地方分离株与疫苗株抗原交叉性。结果表明,NDV-MM,NDV-LD 2个野毒株HI效价与NDV-LD HI效价相近,但比La Sota HI效价低2．3个～2．7个滴度;NDV-NH与F48E9 HI效价相近,比La SotaHI效价低4．2个～4．3个滴度,提示以上3个野毒株与疫苗株之间的抗原相关性差异较大。动物免疫保护试验结果表明,经La Sota免疫（HI效价〉2^5）后攻毒保护率为80％-100％。  相似文献   

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素单克隆抗体的制备及初步应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

张志妮  张伟娟  林燕清  顾万军  黄良宗  朱军  姚丰华  朱国强 《中国动物传染病学报》2009,17(4)

据猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)apxⅣ毒素基因5'端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App 1～12血清型菌株的保守5'端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3 kDa的可溶性重组蛋白.以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体(McAb).以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞587和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1:64、1:128和1:64 000、1:128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以(NH4)2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的587单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8 μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素(rApxⅣ)的最低检出量为60 pg/mL.从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断.  相似文献   

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用     

张志妮  ;张伟娟  ;林燕清  ;顾万军  ;黄良宗  ;朱军  ;姚丰华  ;朱国强 《中国兽医寄生虫病》2009,(4):36-42

据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。  相似文献   

巴泰病毒G1189aa-239aa肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立     

员晓庆  李丽霞  唐甜  陈盛楠  梁晓彤  黄良宗  司兴奎  张浩吉  孙秀涛  段文学  金宁一  刘昊 《中国畜牧兽医》2021,48(10):3770-3778

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒（Batai virus,BATV） G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189－239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_189aa-239aa,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_189aa-239aa肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_189aa-239aa肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_189aa-239aa肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段特异性较好。以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5 μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10 000。样品D_{450 nm}值≥0.367为阳性,D_{450 nm}值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1 600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_189aa-239aa肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。  相似文献