我国犬埃立克体病病原分离与鉴定：Ⅱ.我国病原株与其他埃立克体间 …   总被引：11，自引：1，他引：10  

潘华  孙洋 《中国兽医学报》1999,19(6):560-562

应用Ｃｌｕｓｔａｌｗ计算机分析软件,对我国南方基地的埃立克体病原株（Ｇｚｈ９８１）和Ｇｚｈ９８２）与基因库中其他相关埃立克体１６ＳｒＲＮＡ基因进行了匹配分析。结果表明,我国的２种分离株分别与Ｅ．ｐｌａｔｙｓ和Ｅ．ｃａｎｉｓ的遗传距离最小（０．００１）。在系统发育中,Ｇｚｈ９８１和Ｅ．ｐｌａｔｙｓ、ＨＧＥ、Ｅ．ｅｑｕｉ、Ｅ．ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌａ同属一群;Ｇｚｈ９８２和Ｅ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｅｗ  相似文献   

绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答     

谭永安  肖留斌  郝德君  赵静  孙洋  柏立新 《中国农业科学》2017,50(1):86-93

【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。  相似文献   

甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

赵静  孙洋  谭永安  肖留斌  姜义平  柏立新 《中国农业科学》2017,50(22):4316-4324

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1)时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1));制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。  相似文献   

生防菌BS-315对苹果斑点落叶病菌的防治作用     

孙洋  王树桐  胡同乐  任红敏  曹克强 《安徽农业科学》2010,38(18):9587-9588,9737

[目的]研究生防菌BS-315对苹果斑点落叶病菌（Alternaria mali）的抑菌活性、在苹果叶片上的定殖能力以及一些化学农药对生防菌的影响。[方法]采集松本锦苹果健叶,进行离体叶片试验、定殖试验,并进行不同农药对生防菌的影响试验。[结果]枯草芽孢杆菌BS-315对苹果斑点落叶病菌表现出较强的抑制作用,在叶片上涂抹菌体1 d后接病原菌,3 d后抑制效果在90%以上。BS-315能够在松本锦苹果叶片中定殖,定殖量在接种3 d后最大。4种杀菌剂浓度均为田间使用浓度,其中嘧菌酯和多抗霉素对BS-315的生长有一定的促进作用,而多菌灵和丙环唑则完全抑制BS-315的生长。[结论]该研究可为生防制剂的研发和合理使用提供理论依据。  相似文献   

利用CTC染色进行猪精子不同体外获能方法的比较     

梁鸿斌  刘靖清  李复煌  许海涛  牛嘉颖  李晶  孙洋  郭勇  刘云海 《中国畜牧兽医》2010,37(4):171-173

为了探讨不同方法对猪精子体外获能的影响,本试验以猪的新鲜精液为研究对象,分别经肝素上游法、钙离子载体诱导法和咖啡因诱导法进行精子不同获能时间的处理,并利用金霉素荧光染色法（chlortetracycline,CTC）对其获能效果进行检验。结果表明,采用肝素上游法孵育40 min处理后,精子的获能比例显著高于其他各处理组（P<0.05）,说明肝素上游法可以较好地诱发猪精子在体外获能。  相似文献   

荧光实时定量PCR方法检测猪链球菌2型   总被引：5，自引：0，他引：5  

孙洋  刘军  郭学军  李树民  祝令伟  冯书章 《中国兽医学报》2008,28(1):55-58

以猪链球菌2型的荚膜多糖抗原编码基因cps2J为靶基因设计引物,利用SYBR GreenⅠ能特异地与双链DNA结合发出荧光的特性,以ABI7000为平台,建立荧光实时定量PCR检测猪链球菌2型的方法。该方法检测猪链球菌2型参考株和猪链球菌2型国内分离株都呈阳性,具有良好的特异性。整个检测过程于2h内完成,检测限度为24CFU,标准曲线的相关系数为0.997。对5份采集于猪链球菌2型病猪的病料进行检测,结果表明肝脏和脾脏最适于检测。  相似文献   

仔猪腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析     

梁冰  纪雪  周伟  刘哲  孙诗雯  祝令伟  刘军  郭学军  宋振国  田宇飞  孙洋 《黑龙江畜牧兽医》2019,(3):78-82

  相似文献   

双重溶菌质粒制备鸡痢疾志贺菌菌壳的研究     

蒋大伟  刘军  张瑞安  夏力亮  孙洋  祝令伟  冯书章  许兰菊 《中国兽医学报》2013,33(3):371-375

通过将2种不同的重组溶菌质粒转化至鸡痢疾志贺菌中,构建含有双重溶菌质粒的志贺菌重组菌株,以提高该菌菌壳制备的裂解率和稳定性,并对其特性进行研究.用重组溶菌质粒pBV220::E和pBBRIMCS-E共同转化到鸡痢疾志贺菌,构建志贺菌重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRI MCS-E),重组菌株于28 C培养至D600值为0.5时升至42℃继续培养,间隔30 min检测菌液D600值,进行重组菌株的溶菌裂解动力学比较试验,绘制裂解曲线图并计算出裂解率,制备菌壳并对其形态进行电镜观察.重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRIMCS-E)经42℃诱导后可形成菌壳且保留了基本的细胞形态,裂解率达到了99.999 9％.本研究成功制备出鸡痢疾志贺菌菌壳,为研究利用该菌菌壳预防鸡痢疾志贺菌病的可行性奠定了基础.  相似文献   

犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备及免疫学评价     

邢家恺  纪雪  孙洋  祝令伟  姜秋杰  郭学军  刘军  冯书章 《中国兽医学报》2018,(7)

产气荚膜梭菌是引起犬猝死症的主要病原菌,目前临床上还没有预防犬猝死症的疫苗。本试验以分离自犬的A型产气荚膜梭菌为制苗菌株,首先对利用甲醛进行产气荚膜梭菌培养液脱毒的浓度和时间进行了优化,然后利用脱毒后的产气荚膜梭菌培养液对小鼠和犬进行免疫,并对不同佐剂(铝佐剂和油佐剂)和不同免疫途径(皮下注射和腹腔注射)的免疫效果进行评价。结果显示,产气荚膜梭菌灭活疫苗具有良好的免疫保护效果,免疫后小鼠体内可产生高水平的血清抗体,抗体效价最高可达6.25×104。产气荚膜梭菌铝胶灭活疫苗对犬具有良好的安全性,单次免疫(4mL/只)或2次免疫(2mL/只)均可产生良好的免疫保护效果(5/5)。结果表明,本试验制备的犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗可用于预防犬产气荚膜梭菌感染。  相似文献   

猪粪便中耐黏菌素大肠埃希菌的分离与鉴定     

韩一啸  周伟  梁冰  冯书章  孙洋  刘军  祝令伟  纪雪  郭学军 《中国兽医学报》2018,(3):481-485

为比较不同阶段猪粪便中携带耐黏菌素大肠埃希菌的情况,从吉林省长春市某猪场饲养的生长哺乳期、生长育成期、生长育肥期3个阶段的猪粪便样品中分离耐黏菌素大肠埃希菌。耐黏菌素大肠埃希菌总分离率为47.5%(69/146),其中生长哺乳阶段为66.0%(31/47),生长育成阶段为65.4%(34/52),生长育肥阶段为8.5%(4/47)。通过系统进化分群、接合转移和质粒分型试验对分离菌进行系统鉴定,结果表明,耐黏菌素大肠埃希菌分离株以A群和B1群为主,这些大肠埃希菌携带的质粒共8种基因型,以IncFIB(32/69,46.4%)为主,其次为IncY(14/69,20.3%)和IncFIA(7/69,10.1%)等。其黏菌素耐药机制为携带mcr-1基因,均为质粒携带并可以通过质粒介导的方式发生水平转移,其接合转移发生率为87.0%(60/69)。本研究表明猪耐黏菌素大肠埃希菌并非长期稳定生活在猪肠道内,在不同生长发育阶段存在动态变化,其动态变化规律的成因尚待进一步分析。本研究也为黏菌素耐药性的监测提供参考。  相似文献