猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆与原核表达     

吴丹  童光志  仇华吉  薛强  周艳君  李景鹏 《中国农业科学》2003,36(11):1352-1356

 根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪  相似文献   

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响     

王云峰  石星明  王玫  杨春富  徐灵龙  童光志 《中国兽医寄生虫病》2009,17(1):7-14

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。  相似文献   

表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定   总被引：3，自引：0，他引：3  

陈瑾  田志军  彭金美  王瑜  周艳君  安同庆  童光志 《中国预防兽医学报》2009,31(1)

将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础.  相似文献   

抗乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1单克隆抗体的制备与鉴定     

王斌  华荣虹  赵付荣  刘天强  于海  杜鹃  童光志 《中国预防兽医学报》2009,31(1)

本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株非结构蛋白NS1作为免疫原.免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,共获得4株特异性针对JEV NS1的杂交瘤细胞,分别命名为1H6、2C3、3A7、4C8,经测定1H6单抗亚类属于IgG2b,其他3株为IgG1,轻链均为K链.4株杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价分别达1:20 480、1:2 560、1:20 480、1:10 240,western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可与JEVNS1蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验表明1H6、3A7、4C8 3株单抗能够识别天然的JEV NS1蛋白.本研究为进一步探究JEV NS1蛋白结构及其功能奠定了基础.  相似文献   

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定   总被引：1，自引：0，他引：1  

田野  张雏军  林燕  王群  杨涛  步志高  童光志  张守发  吴东来 《中国预防兽医学报》2009,31(11)

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.  相似文献   

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定     

崔京春  张宝君  钱爱东  王全凯  童光志 《中国预防兽医学报》2009,31(8)

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础.  相似文献   

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建     

许信刚  李健强  王笑梅  童光志 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因,并对ＶＰ２基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 ＶＰ２基因与真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３相连接。结果克隆到 ＶＰ２基因全序列共 １３５６ｂｐ,分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似,同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。  相似文献   

猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究     

刘光清  仇华吉  蔡雪晖  钱平  薛强  童光志  郭宝清 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

本研究对猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的非结构基因,包括ＯＲＦ１基因、５’端非编码区基因（Ｎｏｎ－ＣｏｄｉｎｇＲｉｇｏｎ,ＮＣＲ）和３’端非编码区基因（ＮＣＲ）分别进行了分子克隆和测序,并对其基因特征作了研究分析。结果表明,ＰＲＲＳＶ－ＣＨ－１ａ株ＯＲＦ１ａ起始密码子上游是由保守序列５’ＵＵＡＡＣＣ３’连接的５’ＮＣＲ,在该区附近的约４３个碱基有较高的保守性,其余核苷酸的变异较大。ＯＲＦ１ａ编码的多聚蛋白又可切割生成六个非结构蛋白（Ｎｓｐ１ａ、Ｎｓｐ１β、Ｎｓｐ２－５）,其中Ｎｓｐ２可能具有型特异性,在不同基因型的ＰＲＲＳＶ分离株之间表现出较大的变异,和ＶＲ２３３２株的ＮｓＰ２的编码基因相比有８６％的同源性,同ＬＶ株只有４５％的同源性;ＯＲＦ１ｂ所编码的聚合蛋白经切割后形成四个非结构蛋白（ＲｄＲｐ、ＣＰ２－４）,同 ＯＲＦ１ａ所编码的蛋白相比较为保守,但是,在ＣＰ４的Ｃ端仍有较大的变异,其编码区和ＶＲ２３３２株相比有８８．７％的同源性,而和ＬＶ株只有５３．４％的同源性。ＣＨ－１ａ株的ＯＲＦ１ａ－ＯＲＦ１ｂ的衔接区为核糖体移码区,在所有的ＰＲＲＳＶ分离株中高度保守,具有保守的５’ＵＵＵＡＡＡＣ３’序列和  相似文献   

一株内源性猪细小病毒的分离与鉴定   总被引：3，自引：0，他引：3  

李昌文  仇华吉  童光志  田志军  王玉春  韩孝成  刘红全  董齐 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

本研究从不明病毒污染的ＰＫ１５细胞培养物中分离到了一株猪细小病毒,从形态学、血清学、分子生物学几个方面对其进行了鉴定,同时克隆了该毒株ＶＰ２基因,并测定了其核苷酸序列。将该毒株命名为ＳＹ－９９株。  相似文献   

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建     

王柳  杨志彪  刘红全  智海东  仇华吉  童光志 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。  相似文献