新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性     

陈海鹏  云涛  张存  余斌  倪征  华炯钢  崔言顺 《浙江农业学报》2014,26(6):1448

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT\|PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到pET\|28a（+）原核表达载体,获得重组质粒pET\|28a（+）\|σC。将重组阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达后经SDS\|PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 kDa。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。  相似文献   

表达小鹅瘟病毒VP2蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性   总被引：2，自引：1，他引：1  

陈柳  余斌  倪征  华炯钢  叶伟成  云涛  张存 《中国农业科学》2016,49(14):2813-2821

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病,鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据2012年国际病毒分类委员会（ICTV）的报告,DEV被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究,而近几年也有关于鸭瘟病毒（DEV）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段,本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上,构建表达小鹅瘟病毒（GPV）主要免疫原蛋白VP2的重组病毒rDEV-VP2,并研究其生物学特性,进而探讨重组病毒rDEV-VP2作为防治DEV和GPV的二联重组活载体疫苗的可能性。【方法】将密码子优化的GPV VP2基因通过常规基因克隆的方法插入转移载体pEP-BGH-end,构建含有GPV VP2表达框pCMV-VP2-BGH-pA的重组表达质粒。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T”两步重组法将GPV VP2基因表达框插入到DEV US7和US8基因之间构建了突变体克隆pDEV-VP2。利用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得重组病毒rDEV-VP2和删除Bac质粒序列的rDEV-VP2-Cre,并对重组病毒细胞体外生长曲线、蚀斑大小和VP2蛋白表达情况进行测定。将rDEV-VP2接种番鸭,在不同时间采集血清,采用间接ELISA法检测血清中GPV VP2抗体产生情况。【结果】间接免疫荧光检测和Western blotting分析表明,外源蛋白VP2在CEFs细胞成功表达。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果显示,rDEV-VP2在CEFs细胞上的增殖滴度与亲本株相比无显著差异,表明外源基因VP2的插入不影响rDEV重组病毒的增殖。动物试验结果表明,7日龄雏番鸭接种rDEV-VP2可以诱导产生针对GPV VP2的抗体,免疫后3周抗体阳性率为50%（4/8）。【结论】本实验将小鹅瘟病毒的主要免疫原基因VP2插入到DEV疫苗株基因组的US7和US8基因间构建了表达该免疫原性基因的重组鸭瘟病毒细菌人工染色体,继而在鸡胚成纤维细胞（CEFs）上拯救获得了重组病毒rDEV-VP2,病毒细胞生长特性与亲本株基本一致,且能诱导鸭体产生GPV VP2特异性的抗体。该研究为研制DEV-GPV二联重组活载体疫苗奠定了基础。  相似文献   

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达     

哲名家  张淼涛  云涛 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2012,40(4):21-24

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。  相似文献   

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定   总被引：1，自引：0，他引：1  

邓晓辉  陈柳  叶伟成  李军星  崔尚金  余斌  云涛  崔言顺  孙元  仇华吉  张帅  张存 《中国预防兽医学报》2012,(4):251-256

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

我国北部一淡水湖野生黑颈??死亡的原因调查     

贾皓  宝音达来  武拉俊  马立峰  戴晓光  申捷  萨茹拉  郝璐  云涛  郭文  苏胜杰  郭金贵  菊花  刘志伟  崔基贤  孙鹏飞  王大伟  赵心力 《中国动物检疫》2017,34(3):30-33

2015年5月14—15日,内蒙古自治区某淡水湖出现大量黑颈??死亡。5月21日,内蒙古自治区动物疫病预防控制中心组织相关专家赶赴现场,开展了紧急流行病学调查,分析黑颈??的死亡原因,评估该事件对当地家禽养殖的风险。调查结果显示:此次事件中的黑颈??死亡率约为46.2%,未发现有其他鸟类和家禽死亡;该淡水湖周围5 km范围内的其它地点未有禽类死亡,对该范围内的活野鸟和家禽进行抽样检测,未检出禽流感病原,但国家禽流感参考实验室从送检的死亡野鸟病料样品中均检出H5N1亚型高致病性禽流感病毒,并且检测发现该区域内家禽的H5亚型禽流感免疫抗体合格率较低;在野鸟向家禽传播疫病的7个风险因素中,家禽养殖方式、家禽免疫状况的风险程度较高。调查认为,本次黑颈??死亡事件是由其自身所携带的禽流感病毒暴发所引起的,该区域内家禽发生疫情的风险不高。  相似文献   

禽类病毒免疫逃避的机制     

云涛  余斌  倪征  华炯钢  李双茂  陈柳 《黑龙江畜牧兽医》2011,(6):28-30

为了在宿主体内生存,病毒在进化过程中形成了一系列逃避机体免疫的能力,包括潜伏感染、抗原变异、干扰抗原加工和呈递、调节宿主细胞因子网络、调控细胞凋亡以及抑制补体抗体系统等.本文以禽病毒为例对病毒免疫逃避的机制进行了综述.  相似文献   

几种布鲁氏菌病检测方法的比较     

郝璐  戴晓光  申捷  萨茹拉  马晓雪  苏胜杰  云涛  双燕  马立峰 《中国奶牛》2014,(15):23-26

为研究虎红平板凝集试验(RBT)、全乳环状试验(MRT)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)及胶体金检测试纸条对布病的检测效果,本研究采用以上方法分别对感染地区和净化地区的牛群血清、羊群血清、牛群奶样进行了检测效果的比对。结果显示,针对牛群血清,RBT结果阳性率最高,iELISA与胶体金结果阳性率相似,表明RBT的敏感性较好,iELISA与胶体金检测试纸条的特异性较RBT好;针对羊群血清,iELISA与胶体金检测试纸条的敏感性和特异性较RBT好;针对牛群奶样,MRT结果阳性率低于全乳iELISA和胶体金检测试纸条。全乳iELISA和胶体金检测试纸条在试验中显示出具有较高的敏感性和特异性。  相似文献   

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响   总被引：1，自引：0，他引：1  

郭慧琛孙世琪  云涛张腾国  包慧芳陈应理马军武  刘湘涛刘在新 谢庆阁 《中国兽医科技》2004,34(3):12-17

将携带O型FMDV China99株P1-2A、部分2B及3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDV China99株3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖活性，以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化，并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明，FMDDNA疫苗与3D蛋白共同免疫豚鼠后，抗体水平没有明显提高，攻毒后的保护率为25％。  相似文献   

兔病毒性出血症病毒JX/97株衣壳蛋白基因的序列测定与分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘光清  倪征  张玉颖  云涛  梁华丽  华炯刚  李双茂 《农业生物技术学报》2006,14(2):191-196

对中国兔病毒性出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV)JX/97株的衣壳蛋白基因进行了克隆和测序。结果表明,该蛋白的核苷酸序列长度为1739nt,推导的氨基酸序列为579aa。利用分子生物学软件分析了该病毒与国内外22!RHDV的基因序列,结果显示,RHDV不同分离株之间的序列同源性几乎都在90%以上。衣壳蛋白基因的系统发生树分析结果表明,所选的RHDV参考毒株按照一定的遗传距离,可以分为4个基因群,基因群之间的距离有加大的趋势,表明RHDV受环境的影响有向不同方向演变的趋向,即RHDV在长期适应特定环境的过程中,有可能逐渐演变成各具特色的RHDV。  相似文献   

禽脑脊髓炎研究进展   总被引：1，自引：0，他引：1  

葛俊伟关云涛  杨增岐陈洪岩 《动物科学与动物医学》2003,20(10):62-64

禽脑脊髓炎是小核糖核酸(RNA)病毒科肠病毒属的禽脑脊髓炎病毒引起的一种以侵害幼鸡为主的急性、高度接触性传染病。本病呈世界性分布。对养禽业尤其是种禽饲养业造成极大危害。本文就禽脑脊髓炎病毒的基因结构、致病机理、免疫等问题作简要综述。  相似文献