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大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测 总被引：9，自引：2，他引：7
采用超声波裂解细菌，高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV3AB非结构蛋白进行纯化，经SDS—PAGE分析，3AB融合蛋白纯度达90％以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性，通过Westernblotting分析，表明复性后的3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明，复性后的3AB融合蛋白有很好的抗原活性。 相似文献
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中国猪瘟C-株(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆 总被引：9，自引：1，他引：8
应用RT-PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从实验感染兔脾组织的总RNA中得到了覆盖猪瘟病毒(CSFV)C-株全基因组的7个cDNA重叠片段，分别克隆于pMD18—T或pGEM-T Easy载体后进行测序。运用T-A克隆和多片段一步连接法，将cDNA重叠片段F1、F2、F3、F4与F5、F6、F7分别克隆到pGEM-5Zf( )载体后，得到两个半长cDNA亚克隆重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-4和pGEM-5Zf( )／F5-7。再将两个半长cDNA重叠片段连接并克隆到pGEM-5Zf( )载体，构建出了CSFVC-株全长cDNA重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-7。全长cDNA的成功构建为进一步研究CSFV分子生物学提供了良好的工具。 相似文献
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口蹄疫病毒真核表达质粒的构建及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据定点突变的原理，获得包含有口蹄疫病毒Pl、2A、3C及部分2B编码区的目的基因片段，经KpnI和XbaI双酶切后，与经同样处理的真核表达质粒载体pcDNA3．1( )连接。经鉴定及DNA序列分析，口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1( )上，且目的基因上的XbaI位点成功突变。 相似文献
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Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。 相似文献
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根据测定的口蹄疫病毒（FMDV）2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21（DE3）pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印（EITB）方法提供了所需的材料。 相似文献
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口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测 总被引：5，自引：0，他引：5
以口蹄疫病毒OLZ02株基因组序列为材料，采用Garnier—Robson法、Chou-Fasman法和Karplus—Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构，用Kyte-Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性，Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性，Jameson—Wolf法预测了各蛋白的抗原指数，综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明，VPl蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多，是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原，但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位，有的甚至有可能成为优势抗原表位。 相似文献
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在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3～5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2～3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。 相似文献
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采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代. 相似文献
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为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼VHH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×107,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。 相似文献