牛结节性皮肤病疫苗研究进展     

谢士杰  朱俊达  王天坤  胡鑫  魏雯娟  吴文学  彭辰 《中国畜牧兽医》2021,48(11):4220-4230

牛结节性皮肤病可对病畜皮肤造成永久性损害，并会导致产奶量下降、生长发育迟缓、公畜不育和孕畜流产等严重后果，对经济生产具有重要影响。目前尚无治疗该病的特效药，使用安全有效的疫苗是防控该病传播的重要手段。牛结节性皮肤病弱毒活疫苗在许多国家已被成功用于该病的防控，除此之外，由于牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒及绵羊痘病毒在基因组序列上的高度相似性，山羊痘病毒弱毒活疫苗和绵羊痘病毒弱毒活疫苗在许多地区也被用于该病的防控。牛结节性皮肤病病毒编码基因较多，目前尚未发现基因缺失疫苗和亚单位疫苗具有好的保护效果。近年来灭活疫苗在实验室研究中取得了较大进展，但仍需进一步大规模临床试验以证明其有效性。此外，牛结节性皮肤病病毒作为一种痘病毒，已被证明是表达多种病原微生物抗原的有效载体之一。笔者主要总结了当前牛结节性皮肤病疫苗的研究进展，对弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失疫苗和亚单位疫苗的使用情况、保护效果及研究方向等方面进行了综述，以期为牛结节性皮肤病疫苗的研发和疫病的防控提供新的思路和见解。  相似文献   

猪干扰素γcDNA的分子克隆与在大肠杆菌中的表达   总被引：13，自引：0，他引：13  

吴文学  夏春  汪明  蒋金书 《农业生物技术学报》2002,10(3):255-258

采用RT-PCR技术从猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素γcDNA(SwIFN-γ2).SwIFN-γ2与已报道的猪干扰素γ序列基本一致,仅在462位核苷酸处发生了点变异.在SwIFN-γ2成熟蛋白基因两端分别合成含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pQE30表达载体,转化宿主菌SG13009(pREP4),经IPTG诱导表达了N'端含6个组氨酸的重组猪干扰素γ(6His-rSwIFNγ2).重组干扰素的表达量占总菌体蛋白的33.5%.采用Ni-NTA金属螯合亲和层析纯化6His-rSwIFNγ2,其纯度达90%以上,经8 mol/L尿素溶液变性、透析复性后,其抗滤泡性口炎病毒比活性为8×103～1.6×104U/mg.  相似文献   

牛支原体等温扩增冻干试剂盒研究     

吴彤  刘旭  李佳禾  闫新博  张宁  吴文学 《中国农业科学》2016,49(16):3251-3260

【目的】牛支原体(Mycoplasma bovis)是导致牛多种疾病综合征的病原体之一,在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况,迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞,获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后,获得质粒浓度为10~4拷贝/μL的溶液,作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液(主成份为SYBR Green I和HNB),分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术的基础上配制等温扩增试剂,并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂,每种保护剂分别选用3种不同的浓度,共设计27种保护剂组方,通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂,放到冻干机中测定共晶点,并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定,筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液,组装成试剂盒。利用6个浓度梯度(10~0-10~5个拷贝)重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性,利用浓度为10~4 CCU·mL~(-1)的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10~8CCU·mL~(-1)的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10~8CFU·mL~(-1)的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌,检测试剂盒的特异性。另外,将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存,检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影响等温扩增反应,在此基础上优选的冻干保护剂配方为5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白,等温扩增试剂共晶点为-16℃,一次干燥的升温时间3h,一次干燥时间6h,二次干燥时间4 h。组装后的试剂盒最低可检测到10个拷贝数的重组质粒,检验PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原体均为阳性,检验牛鼻支原体、无乳支原体、多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌均为阴性。试剂盒在20℃保存6个月、37℃保存10 d后,敏感性仍为10个拷贝数,与第0天相同,推测4℃保存有效期为24个月左右。【结论】笔者研制的等温扩增冻干试剂盒敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷,适合基层兽医现场检测使用。  相似文献   

牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立     

刘梦瑶  王展慧  吴浩  谷月  吴文学 《畜牧兽医学报》2021,52(7):1942-1952

利用多重荧光定量RT-PCR （real-time RT-PCR）方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒（BAstV）ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）5'端非编码区,牛冠状病毒（BCV）N pro基因和牛轮状病毒（BRV）VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示：Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^-1,探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^-1。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为10²copies·μL^-1,对BAstV的最低检测限为10³ copies·μL^-1,具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。  相似文献   

牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究     

侯轩  付萍  张海燕  张跃伟  吴文学 《农业生物技术学报》2012,20(2):218-224

牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用.  相似文献   

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

李佳禾  李一婧  付萍  张跃伟  黄书林  郭盼盼  蒋菲  吴文学 《农业生物技术学报》2009,17(6):948-953

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。  相似文献   

补体C9分子原核表达与多克隆抗体的制备     

邓亦宁  张云科  吴文学 《中国兽医杂志》2019,(2):49-53

通过大肠杆菌表达系统表达补体C9重组蛋白,并制备其多克隆抗体,用于检测沉积菌体表面的补体C9分子;方法:通过PCR以兔肝细胞cDNA文库为模板扩增获得补体C9部分基因,并将其克隆至原核表达载体pEASY.-Blunt E1,经测序鉴定成功获得重组质粒pBlunt-C9。将其转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,获得重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备抗C9的鼠源多克隆抗体。结果显示,ELISA测得鼠抗C9多克隆抗体效价为1∶12800,Western Blotting表明,制备的多克隆抗体可以特异性识别沉积在金黄色葡萄球菌和链球菌表面的C9分子,为进一步研究补体的生物学功能以及巩膜复合体(MAC)抗细菌感染机制奠定了基础。  相似文献   

荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用   总被引：5，自引：0，他引：5  

张跃伟  李旭妮  郭盼盼  付萍  李佳禾  黄书林  蒋菲  吴文学 《农业生物技术学报》2010,18(3):508-513

介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV.  相似文献   

头孢菌素类抗生素的研究与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

吴文学  高光 《中国兽药杂志》2003,37(9):32-36

头孢菌素类抗生素目前已发展到第四代，有数十种产品应用于临床。本文从抗菌活性、稳定性、药代动力学、兽医临床应用、耐药性及毒性等方面对头孢菌素类抗生素进行了综述。  相似文献   

弓形虫病的诊断现状     

朱引洁  吴文学  索勋 《中国兽医杂志》2006,42(10):56-57

弓形虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病，病原为龚地弓形虫（Toxoplasma gondii），1908年，法国学者Nicolle于北非的一种刚第梳趾鼠的体内首次发现，现广泛分布于除南极洲外的世界各地，估计全球有1／3人口遭受感染。除人外，弓形虫还可感染包括兽类、鸟类、啮齿类、鱼类和爬行类等190多种动物，人的先天性弓形虫病在胎儿或婴幼儿可出现发育畸形、智力障碍、脑炎、脑膜炎甚至死亡等的临床症状。在免疫抑制及免疫缺陷人群，如器官移植、恶性肿瘤及爱滋病患者中，弓形虫病也是常见的致死病因之一。  相似文献