草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用   总被引：3，自引：0，他引：3  

刘宝芹  曾伟伟  王庆  张乐生  王英英  石存斌  吴淑勤 《中国水产科学》2012,19(2):329-335

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。  相似文献   

大口黑鲈烂身病病原菌的分离、鉴定与特性分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘春  李凯彬  王庆  马必勇  卞荣玲  王芳  吴淑勤 《广东农业科学》2011,38(6):126-128

从患烂身病的大口黑鲈溃烂部位分离到优势菌株M-1。人工回归感染试验结果显示,分离的菌株M-1能复制出相似症状;对M-1菌株进行形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为嗜水气单胞菌;对M-1菌株进一步进行DNA分子鉴定,结果显示该菌的16S rRNA基因、溶血素(hemolysin,hlyA)基因,均与GenBank上已登录的嗜水气单胞菌的相应基因具有较高同源性;利用16S rRNA和hlyA构建的系统进化树也显示M-1菌株与与嗜水气单胞菌聚为一类。综合人工回归感染试验、理化特性分析与基因鉴定结果,确定患烂身病的大口黑鲈应为嗜水气单胞菌感染。  相似文献   

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用   总被引：1，自引：1，他引：0  

殷亮  王庆  曾伟伟  李永刚  王英英  刘春  梁红茹  石存斌  吴淑勤 《水产学报》2014,38(4):570-576

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。  相似文献   

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用     

刘春  曾伟伟  王庆  李凯彬  王芳  常藕琴  梁慧丽  吴淑勤 《水产学报》2014,38(1):136-142

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。  相似文献   

草鱼头肾发生组织学与免疫组织化学观察   总被引：1，自引：1，他引：0  

雷雪彬  常藕琴  石存斌  付小哲  王亚军  吴淑勤 《水产学报》2013,37(6):840-850

为研究草鱼头肾的组织发生发育,应用组织学技术,对1 ～ 103 dph(day post hatching)的草鱼头肾进行观察分析,描述了头肾的组织结构变化及免疫球蛋白M(IgM)阳性细胞及过碘酸雪夫氏(PAS)阳性细胞的发生和分布.结果显示,6 dph,出现头肾原基,原基中原肾管分化形成的肾小管之间出现散在的干细胞.7 dph至16 dph,造血干细胞逐渐分化成不同类型的细胞,免疫细胞数量逐渐增加;17 dph至103 dph,肾小管逐渐退化至完全消失,网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成头肾的主要部分.40 dph肾上腺细胞团开始出现.65 dph与成鱼头肾的组织结构接近,作为淋巴-肾上腺组织存在.PAS阳性细胞最早在7 dph出现;IgM阳性细胞最早出现于17 dph;之后,IgM阳性细胞及PAS阳性细胞逐渐增多,分布于整个头肾组织.研究表明,65 dph草鱼头肾在组织上发育基本成熟;头肾作为草鱼免疫器官的早期发育可以分为3个阶段:无参与免疫反应的细胞、只具有参与非特异性免疫反应的细胞以及参与非特异性免疫反应及特异性免疫反应的细胞组织结构逐步发育完善.  相似文献   

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析     

付小哲  李宁求  彭媛媛  林强  石存斌  黄志斌  吴淑勤 《中国水产科学》2013,20(2):427-433

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。  相似文献   

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列（摘要）     

刘礼辉  李宁求  石存斌  吴淑勤 《农业科学与技术》2010,11(7):179-182

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA基因的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA序列基因,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列,具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。  相似文献   

定量PCR检测不同温度下免疫后剑尾鱼IgM的表达     

张铃铃  任燕  王庆  石存斌  吴淑勤 《上海水产大学学报》2010,(3)

利用两步法荧光定量RT-PCR法,检测不同温度下剑尾鱼免疫后脾脏和头肾组织中免疫球蛋白M(IgM)mRNA水平,发现其在不同温度下随着免疫时间呈现出不同的变化趋势。结果显示,在18℃水温下,剑尾鱼的IgM在两种组织中转录水平上升得较慢,随着水温的升高,在23℃、28℃水温下,其IgM表达水平上升较快,尤其是在28℃水温下,IgM表达水平迅速上升,且达到一个最高值,但在33℃较高水温条件下,IgM表达量并没有更高的上升幅度,而是与18℃水温下的IgM表达相比有所提高。本实验结果表明剑尾鱼注射免疫后在脾脏和头肾中都检测到了IgM表达的上调,高于33℃或低于18℃,都会影响剑尾鱼免疫效果。实验过程中发现在这种亚适温度下,剑尾鱼摄食量减少,反应比较迟钝,头肾和脾脏中IgM相对表达量也较低。  相似文献   

定量PCR检测不同温度下免疫后剑尾鱼IgM的表达     

张铃铃  任燕  王庆  石存斌  吴淑勤 《上海海洋大学学报》2010,(3)

利用两步法荧光定量RT-PCR法,检测不同温度下剑尾鱼免疫后脾脏和头肾组织中免疫球蛋白M(IgM)mRNA水平,发现其在不同温度下随着免疫时间呈现出不同的变化趋势。结果显示,在18℃水温下,剑尾鱼的IgM在两种组织中转录水平上升得较慢,随着水温的升高,在23℃、28℃水温下,其IgM表达水平上升较快,尤其是在28℃水温下,IgM表达水平迅速上升,且达到一个最高值,但在33℃较高水温条件下,IgM表达量并没有更高的上升幅度,而是与18℃水温下的IgM表达相比有所提高。本实验结果表明剑尾鱼注射免疫后在脾脏和头肾中都检测到了IgM表达的上调,高于33℃或低于18℃,都会影响剑尾鱼免疫效果。实验过程中发现在这种亚适温度下,剑尾鱼摄食量减少,反应比较迟钝,头肾和脾脏中IgM相对表达量也较低。  相似文献   

养殖乌鳢结节病的病原分析     

石存斌  潘厚军  常藕琴  付小哲  段圣和  梁裕昕  吴淑勤 《安徽农业科学》2009,37(16):7384-7386

[目的]分析了解乌鳢结节病的病原。[方法]以患病乌鳢为研究材料,通过组织病理学观察和人工感染试验,确定乌鳢结节病的病原性质 通过基本生理生化特性、16 S rRNA基因部分序列和药物敏感性的测定,对乌鳢结节病的病原进行鉴定。[结果]组织病理学观察显示典型结节的中央为干酪样坏死,内含坏死的组织细胞和白细胞,其间有大量呈长杆状或分枝状菌丝 从病鱼的肾脏、肝脏等多个组织及腹水中均分离培养出细菌,用分离菌株作回归感染,证实分离菌株为乌鳢结节病的病原菌 通过对病原菌的基本生理生化特性测定和16 S rRNA基因部分序列分析,初步确定乌鳢结节病的病原为诺卡氏菌属的鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）。[结论]该研究为乌鳢结节病的进一步研究奠定了基础。  相似文献