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为探明铜离子在朊蛋白构象转化中的作用机制，进一步研究构象病发生机制提供基础数据，利用DNA重组技术，绵羊朊病毒蛋白在大肠杆菌BL2l（DE3）中高效表达，获得绵羊PrP^C重组蛋白（OvPrP^C），与氯化铜在体外结合。对CuCl2处理后的蛋白进行圆二色谱（CD）和蛋白酶K（PK）消化试验进行转化调节后蛋白抗性分析。结果表明，OvPrP^C分子量为25172．80U，其二级结构主要由α-螺旋构成，含少量β-折叠。经过CuCl2体外调节后，OvPrP^C结构中α-螺旋减少，β-折叠增加。而蛋白酶K消化后，CuCl2作用后的蛋白产生了PK抗性。为进一步的神经细胞毒性试验提供了宝贵的材料，进而为探讨构象病发生机理提供有力的科学依据。 相似文献
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以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。 相似文献
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为研究IFN-γ对感染牛分枝杆菌的THP-1细胞的促凋亡作用,及TNF-α在此细胞凋亡过程中的作用和相关信号分子的变化,使用浓度为15 ng.mL-1的IFN-γ作用于不同剂量牛分枝杆菌北京株(MOI10∶1,20∶1)感染的THP-1细胞,在感染后12、24、36、48和72 h,使用流式细胞仪测定细胞凋亡百分比。结果显示,IFN-γ诱导了M.bovis北京株感染的细胞凋亡,并且凋亡呈时间相关性。随着细胞凋亡百分比的增加,牛分枝杆菌的CFU降低。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)处理的巨噬细胞内加入抗TNF-α单克隆抗体,感染后36 h,细胞凋亡百分比测定结果显示,加入抗TNF-α单抗抑制了IFN-γ诱导的M.bovis感染的THP-1细胞的凋亡,与对照组相比,差异显著(P0.05);用分光光度计检测表明Caspase-3和Caspase-8的激活是TNF-α依赖性的。在IFN-γ和M.bovis北京株(MOI10∶1)作用的THP-1细胞内分别加入JNKinhibitor I或NEMO-Binding Domain BindingPeptide,或同时加入2种抑制剂,36 h后测定细胞凋亡情况,与对照组相比,加入抑制剂后,细胞凋亡无显著差异(P0.05),说明在本试验中,JNK通路和NF-κB凋亡通路未被激活。本研究初步阐明了TNF-α在IFN-γ诱导的感染牛分枝杆菌的细胞凋亡过程中的作用及相关信号通路。 相似文献
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采用PCR方法扩增了云南矮马和北京油鸡的PrP^C基因，并进行序列测定，结合已发表种属朊病毒基因序列，运用分子生物学软件进行同源性分析。结果表明，云南矮马PrP^C基因与已报道的马PrP^C基因比较，其同源性达99％，氨基酸同源性达100％。与牛PrP^C基因比较，同源性达89％，氨基酸同源性达91％。北京油鸡PrP^C基因与鸡的已知序列比较，同源性达99％；与鸭、鸽、鹌鹑的已知序列比较，同源性94％～97％。其翻译的氨基酸序列与鸡的已知序列比较，同源性达99％，与鸭、鸽、鹌鹑比较，氨基酸同源性88％～99％。从本试验结果来看，云南矮马PrP^C基因与牛的PrP^C基因同源性较远，因此感染牛源朊病毒的风险较小，禽类与哺乳动物PrP^C氨基酸属于2个不同的进化分支，因此哺乳动物海绵状脑病不易传染给禽类或引起朊蛋白构型上的改变。这些结果可为海绵状脑病种间屏障补充详细的数据，也为制定相关预防控制措施提供了一些理论依据。 相似文献
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探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。 相似文献
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为了给更好地研究神经元病理变化提供物质材料,对新生大鼠大脑皮质神经元进行体外分离和培养。无菌操作取新生大鼠的大脑皮质,采用机械法和胰蛋白酶消化法相结合的方法分离细胞,制备单层细胞悬液接种培养板;5-氟脱氧尿嘧啶处理等方法纯化神经元,甲苯胺蓝染色法及抗NSE单克隆抗体对纯化后的神经元进行鉴定。结果表明,培养的神经元生长良好,形态正常,纯度高达90%以上。采用本方法培养的神经元可作为深入研究中枢系统疾病的细胞模型材料。 相似文献
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