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膜蛋白是禽传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白,可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇,能诱导细胞介导的免疫反应,但其免疫生物学功能尚不清楚.本研究选择禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBWJ,通过RT-PCR扩增获得其膜蛋白基因M基因并插入到PGEM-T载体中,获得重组质粒PGEM-M,将重组质粒中的克隆片段进行序列测定及分析.对PGEM-M进行双酶切获得M基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过菌落PCR、双酶切证明获得了M基因的真核表达质粒.利用DNAstar软件将IBV SAIBwj株的膜蛋白基因的核苷酸序列与GenBank中的国内外参考毒株进行比较,其核苷酸序列的同源率为91.6%~98.8%,氨基酸序列的同源率为91.6%~99.6%.糖基化位点的增加和减少对M蛋白的抗原性产生很大的影响.在M蛋白近N端含有两个糖基化位点,第一个跨膜疏水区距离亲水区大约20个氨基酸.SAIBwjM基因核苷酸、氨基酸进化关系可以看出,SAIBwjM与国内外参考株的同源性均较高,因此可能具有交叉保护性抗原,可望用于制备诊断试剂及制备基因工程疫苗.由于IBV变异较大,常规疫苗不能产生完全保护力.在IBV的免疫保护机制中,细胞免疫起着关键的作用,近年来一些研究者已经进行了IBVDNA疫苗的研究,并取得了一定的进展.IBV的S1基因真核表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应,由于S1基因经骨骼肌细胞内源性表达后主要通过MHCI类分子提呈抗原,特别有利于CD8+细胞毒T淋巴细胞的激活,对IBV免疫保护极有意义.陈洪岩等将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒,经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高,至35日龄左右达到高峰,但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗.质粒DNA免疫攻毒后有40%的鸡可耐过强毒的攻击,说明S1基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力.刘思国等将鸡传染性支气管炎HB株的核蛋白基因(N基)亚克隆到pcDNA3,构建了真核表达质粒pcDNA-N.用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验,结果保护率为40%,表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用.现在的DNA疫苗研究主要集中在免疫原性较高的N基因和S基因,对免疫原性较低的M基因的研究,国内未见报道.国外有报道M蛋白也能刺激机体产生低水平的抗体,M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇,本研究将为进一步研究M基因的免疫原性及其在IBV中的作用基础材料. 相似文献
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从表现腹泻、神经症状、肠道粘膜局部出血、坏死以及卵泡充血、出血为特征的病死产蛋鸭分离到一株病毒,经血凝(hemagglutinin,HA)、血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)和血清中和试验(seium neutralization,SN)及部分融合蛋白(F)基因的序列测定初步鉴定为新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为JSD0812株。该毒株10日龄SPF鸡胚平均死亡时间(mean deathtime,MDT)为54.6h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)为1.75,6周龄SPF鸡静脉接种指数(intravenous pathogenicity index,IvPI)为2.68,其F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q—K—R—F^117,上述结果符合NDV强毒株的分子特征,证实该毒株为NDV强毒株。致病性试验表明该毒株对鸡、鸭和鹅均有很强的致病性. 相似文献
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应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。 相似文献
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为了研究禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白A(Omp A)的免疫原性,根据C48-1菌株Omp A基因序列设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增去信号肽的成熟Omp A基因.将去信号肽的成熟Omp A基因扩增片段双酶切后,克隆到p GEX-6p-1表达载体中,构建重组表达质粒p GEX-Omp A,转化宿主菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE的结果显示,融合蛋白GST-Omp A大小约为63 ku,与预期的分子质量相符.免疫印迹分析结果表明,该融合蛋白与鸡抗Pm血清具有明显的免疫反应,说明Omp A具有良好的抗原性,这为禽Pm Omp A在免疫防御研究中的应用奠定了基础. 相似文献
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根据GenBank中公开的鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源NDV JG97分离株的HN基因.将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定.结果表明,扩增的基因片段含1个完整的、长1 716 bp的HN基因阅读框(ORF),编码的571个氨基酸中含13个Cys残基和5个潜在的糖基化位点.同源性分析结果表明,JG97株与SF02、GD/1/98/Go、JS/1/97/Go、JS/2/98/Go、JS/5/01/Go、NA-1、SD/5/04/Go和ZJ/1/00/Go等8个毒株的HN基因和氨基酸同源性分别为96.3%~98.2%和97.0%~98.9%,而与F48E9株分别为84.8%和89.8%,与La Sota株分别为82.1%和86.9%,表明JG97株与我国其他鹅源NDV毒株的亲缘关系较近,它们可能具有共同的来源,但与经典NDV毒株间差异较大.此外,鹅源NDV毒株HN蛋白中有6个独特的氨基酸变异,另有14个仅与Taiwan95和VOL95毒株共有的氨基酸变异. 相似文献
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用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码Cap蛋白的基因(ORF2),将ORF2插入到真核表达载体pcI)NA3.1( )中构建重组质粒pcDNA-PCV-ORF2,然后肌肉注射免疫小白鼠,通过ELISA诊断试剂盒检测小白鼠的血液中特异性抗体的变化情况.试验结果表明:小白鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第1周开始产生抗体,第4周抗体水平达到最高,抗体可维持10周以上.本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础. 相似文献
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IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性 总被引:1,自引:0,他引:1
将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。 相似文献