应用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒     

夏平安 《中国预防兽医学报》1997,(3)

取０．５ｍｌ兔ＢＨＫ－２１新鲜健康细胞液和０．１ｍｌ狂犬病病毒细胞液在含小飞片青瓶中混合，培养２４小时后制片，加抗狂犬病病毒兔抗体感作，用驴抗兔荧光抗体染色，通过荧光显微镜观察细胞浆内黄绿色结构判定病毒是否在细胞内增殖，从而建立了检测狂犬病病毒的间接免疫荧光法（ＲＦＡＴ）。用ＲＦＡＴ检测５批Ｆｌｕｎｇ－ＬＥＰ株培养液，５批ＥＲＡ株培养液和５批鹿毒８２０２株培养液，ＴＣＩＤ５０平均滴度分别为５．６８、６６０５、４．８６；对小鼠脑内接种，ＭＬＤ５０平均滴度分别为５．５、５．５６、４．２５。从试验结果看，ＲＦＡＴ是取代ＭＬＤ５０测定法的理想方法。  相似文献   

PRRSV Hr-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建     

卢高峰  夏平安  邱璜  李伟娟  王中明  刘明莉 《安徽农业科学》2008,36(26)

[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础.  相似文献   

猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备   总被引：1，自引：1，他引：0  

张继希  张志远  张宜娜  周永辉  张祥  郝一妹  张元元  夏平安  崔保安 《中国畜牧兽医》2012,39(9):50-53

本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。  相似文献   

PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因表达载体的构建及高效表达     

卢高峰  夏平安  刘明莉  李伟娟  邱璜  李素平 《江西农业学报》2009,21(1)

通过对PRRSV Hn-1/06株ORF5基因序列分析,设计删除信号肽和跨膜功能区的ORF5序列的3对引物,应用重叠延伸PCR以PTG19-T-ORF5质粒为模板进行扩增目的片段,得到长度为410 bp的片段。然后将此基因亚克隆到原核表达载体PET32a,经筛选获得了阳性重组质粒PET32a-ORF5abc,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为34 kD的融合蛋白GP5abc-His,Western blotting检测结果证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达     

刘明莉  李伟娟  王中明  邱璜  卢高峰  夏平安  李素平  崔保安 《江西农业学报》2009,21(3)

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。  相似文献   

鸡约氏乳杆菌的分离鉴定及进化分析     

张凤华  夏平安  崔保安  张红英  郭国富 《中国畜牧兽医》2010,37(1):74-76

从3日龄健康小鸡肠道中分离到1株乳杆菌,用PCR方法从分离菌株扩增16S rRNA基因,获得大小为1340 bp的DNA片段,该片段的核酸序列已提交GenBank,登录号为EU290749。将分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上其它乳杆菌进行同源性分析并建立进化树。结果表明,分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与NCBI公布的鼠约氏乳杆菌分离株(AB295648)的同源性为99.6%,因此该分离菌株被鉴定为鸡约氏乳杆菌(chicken Lactobacillus johnsonii),命名为HN/0711。  相似文献   

猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析     

徐红运  夏平安  王中明  张凤华  卢高峰  刘玉松  崔保安 《中国畜牧兽医》2010,37(4):66-70

为研究猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγR Ⅲ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的猪FcγR Ⅲ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9％;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽（20个氨基酸）、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。  相似文献   

河南省猪场戊型肝炎病毒流行病学调查     

慕春龙  夏平安  张龙现  崔保安 《中国畜牧兽医》2011,38(8):197-201

为了解河南地区猪戊型肝炎感染情况,同时掌握该地区猪感染戊型肝炎病毒的基因型,对来自河南新乡、平顶山、南阳等地区不同商品猪场血清、肝脏、粪样品,采用ELISA技术检测猪血清中抗HEV特异性抗体水平,并使用套式RT-PCR检测肝脏和粪便中猪戊型肝炎病毒核酸。结果显示530份样品中HEV抗体阳性率0.6%,HEV RNA均为阴性,推测目前河南省猪戊型肝炎病毒感染率较低。  相似文献   

广东省猪圆环病毒2型毒株分离 及全基因序列分析     

孟张丽  梁鹏帅  夏平安  刘燕玲  李艳  蒋智勇  蔡汝健  宋长绪员 《广东农业科学》2014,41(7):149-154

为了解广东省猪圆环病毒2 型(PCV2）的流行、变异及进化情况,对2013 年广东省多个猪场发生PCV2 感染的病猪血清进行PCV2 病毒分离,参考GanBank 上已发表的PCV2 全基因序列,设计3 对引物,用PCR 方法扩 增其全基因序列,测序并进行序列分析。结果分离到9 株PCV2 毒株,全基因序列长度都为1 767 bp。同源性分析表 明,9 株PCV2 分离株核苷酸同源性为93.6%~99.4%,与2012 年分离株同源性为94.5%~99.7%,与2011 年分离株同 源性为94.2%~99.7%,与GenBank 中其他PCV2 分离株的同源性为93.2%~99.7%。9 株PCV2 的ORF2 核苷酸及其推 导的氨基酸序列同源性分别为89.0%~99.9%和86.4%~100%,存在一定的变异。基因型分析表明,有5 株属于 PCV2d,3 株属于PCV2b,1 株属于PCV2a。对2011要2013 年分离的PCV2 基因组特征进行分析,发现PCV2 核苷酸序 列比较稳定,与世界其他分离株也具有较高的同源性。  相似文献   

SOE-PCR法检测PRRSV ORF5缺失跨膜区的融合蛋白基因片段的研究     

刘明莉  夏平安  党占国  王中明  邱璜  卢高峰  李伟娟 《黑龙江畜牧兽医》2009,(3)

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒,含有8个开放阅读框（open reading frames,ORFs）,其中ORF5—7分别编码PRRSV主要的结构蛋白：糖基化囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。糖基化囊膜蛋白（E）又称GP5蛋白,具有良好的抗原性和免疫原性,分子质量约为25ku。重叠延伸PCR技术简称SOE—PCR,又称重叠区扩增基因拼接法、交错延伸剪接PCR技术或套叠PCR技术。此技术利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变,而且不需要内切酶消化和连接酶处理。研究在分析了GP5蛋白跨膜区之后,采用SOE—PCR的方法将跨膜区基因缺失,对GP5蛋白编码跨膜区外的基因片段进行了克隆,旨在为获得高表达、高活性的基因产物打下基础。  相似文献