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将犬γ干扰素基因和表达载体pET30a双酶切后构建了重组质粒pET30a-CaIFN-γ,并转化到E.coliRosetta感受态中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白约23 ku并主要以包涵体形式存在。包涵体通过切胶纯化后肌注家兔,制备出CaIFN-γ的抗血清,测得血清效价为1:12 800。对复性后的包涵体通过细胞试验进行抗病毒活性检测,表明重组犬γ干扰素在终浓度为0.09 mg·mL-1时具有一定的抗病毒活性。本试验成功的原核表达、纯化了犬γ干扰素蛋白,制备CaIFN-γ的抗血清,为CaIFN-γ蛋白生物学特深入研究和生产应用奠定基础。 相似文献
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为确定猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）非结构蛋白2（nonstructural protein 2，Nsp2）与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11（PSMD11）之间是否存在相互作用，本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因，并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11，经测序和双酶切验证正确后，转染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀（Co-IP）试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用，并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示，本研究成功扩增了猪源PSMD11基因，大小约为1 474 bp，基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白；Co-IP结果表明，PSMD11与Nsp2之间存在相互作用；共定位试验结果显示，PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中，且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。 相似文献
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鲤鱼出血病病原的研究和药敏试验 总被引：4，自引：0，他引：4
从患出血病鲤鱼的肝脏和心血中分离到两种细菌,人工感染试验均出现与自然病鱼相同的症状。其致病力达100%,死亡率分别为65%和50%,两种菌混合感染时死亡率高达90%,两者致病有协同作用。从人工感染病鱼体内再次分离获得同种细菌。经细菌学鉴定,确定为温和气单胞菌(AeromonassobrHa)和豚鼠气单胞菌(A.cavHae)。药敏试验结果表明,两种菌均对左氧氟沙星、白霉素高度敏感。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-s1,将其电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得了表达PEDV S1蛋白的重组乳酸茵杆菌.重组杆菌诱导后,经western blot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达.将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后于不同时间分别测定了粪便中特异性的sIgA和血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况.结果表明该重组干酪乳杆茵表达系统能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,在肠道可产生分泌型Iga抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫应答.表明所构建的重组干酪乳杆茵表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型猪流行性腹泻口服疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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根据Gen Bank中公布的鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三个基因型中E1基因,选择高保守序列702 bp(436-1137)合成基因,命名为SAV E1,将其克隆到原核表达载体p Cold TF中构建重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western blot鉴定,重组蛋白均获得了表达,表达E1重组蛋白约95 k D。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,制备抗血清。间接ELISA结果显示,鼠抗重组蛋白E1血清效价为1∶25 600;间接免疫荧光结果显示,鼠抗重组E1蛋白血清可与SAV发生特异反应,由此表明表达的E1重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为SAV检测方法的建立提供理论依据。 相似文献
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为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。 相似文献
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为获得表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的乳酸菌表达系统,并分析其免疫反应性和神经节苷脂受体(GM1)结合活性,本研究将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建重组质粒pPG-2-eltb,电转化于干酪乳杆菌393中。筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot和间接ELISA方法鉴定LTB表达情况,并检测其与GM1结合活性。结果显示,目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。GM1-ELISA试验结果证实表达的LTB可与牛GM1特异性结合。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。 相似文献
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以大肠杆菌和乳酸菌穿梭分泌表达型载体pPG612为基本模型,用短乳杆菌S层启动子SlpA替换载体上gusA启动子,并以TGEV N蛋白基因为目基因构建一种乳酸杆菌组成型表达载体,用以检测SlpA启动子在三种不同乳酸杆菌中表达能力。结果表明,该组成型启动子具有表达外源功能蛋白功能,且具有严格宿主选择性,为进一步利用该载体及组成型启动子进行其他应用奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。 相似文献
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E亚群禽白血病病毒（ALV-E）是指存在于鸡染色体中的内源性逆转录病毒基因组DNA或片段。具有转录活性的ALV-E既会对鸡的生产性能（体重和产蛋率）产生负面影响，又能从抗体水平干扰对外源性ALV的鉴别诊断。为对黑龙江省某鸡场内一禽白血病病毒RT-PCR阳性病料进行病毒分离鉴定及分析其基因组特征和遗传进化情况，通过分子生物学、病毒形态学及全基因组序列测定方法对病毒培养物进行鉴定和分析，结果显示，该分离株可在CEF细胞盲传至第9代，电镜下可观察到近似球形、直径约为80 nm，并具有囊膜和纤突结构的病毒粒子，将其命名为HLJE2020株。序列分析结果显示，其全基因组序列中的gag和pol基因相对保守，LTR和env基因与ALV-E同属一个进化分支，而gp85基因则与ALV-E和ALV-B均具有较高相似性，遗传进化分析显示在ALV-E和ALV-B间出现一个单独的分支，结合RDPv.4和SimPlot软件分析结果，推测该毒株gp85基因可能存在E亚群AF229株与B亚群SDAU09C1株的重组现象。本研究为了解禽白血病病毒基因组遗传演化情况提供数据资料，并为ALV的防控提供参考和依据。 相似文献