基因1型狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR检测方法的建立及应用     

刘晔  袁颖烁  张守峰  张菲  张乐萃  扈荣良 《中国兽医学报》2013,33(8)

针对我国狂犬病临床诊断的现实需求,本研究根据狂犬病病毒基因组核苷酸保守序列,设计巢式引物,对引物工作浓度和退火温度进行了优化,并对RT-PCR敏感性、特异性和重复性进行了检验.结果显示,巢式RT-PCR方法最低能够检测0.01 MILD50/30μL的脑组织病毒量,对阳性样品和非狂犬病感染样品的3次重复检测结果均与狂犬病诊断OIE推荐方法(荧光抗体染色法)的确定结果完全一致；在针对203份临床样品的检测中,FAT疑似样品通过MIT和巢式RT-PCR进一步确诊,巢式RT-PCR显示出较高的敏感性和特异性.以上表明,本研究建立的狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR方法高度敏感和特异,可以用于FAT和MIT疑似样品的辅助检测,为试剂盒的研发与应用奠定基础.  相似文献   

我国野生动物鼬獾的狂犬病值得关注     

扈荣良  张守峰  刘晔  赵敬慧  连海  张菲 《中国兽医学报》2013,33(8)

自2006年至今,我们连续7年在江西、浙江和安徽等省份的环千岛湖和环鄱阳湖周围地区开展了国家二类保护野生动物鼬獾的狂犬病监测,并通过文献调阅和实际检测进行了该种动物的回顾性及现行流行病学调查.结果显示,1995年以来,在上述地区(包括浙江北面的湖洲至南面的温洲和丽水等地区、安徽黄山地区和江西环鄱阳湖周围地区至东北部的景德镇地区、一直到南部的抚州等)周期性的发生过鼬獾狂犬病的流行,5～8年暴发1次,每次持续2～3年,随后持续零星散发.  相似文献   

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建     

康震  扈荣良  房丽君  张守峰  张乐萃 《青岛农业大学学报(自然科学版)》2010,27(2):139-143

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。  相似文献   

汉坦病毒长春分离株YZG-Changchus S基因片段克隆和序列分析     

袁子国张秀香  郝雪李修明  张守峰徐慧娟高胜岩  王晓虎扈荣良 《黑龙江畜牧兽医》2007,(11):68-70

肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with RenalSyndrome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus Pulmonary Syndrom．HPS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属中的病原体引起的一种病情重、病死率高的自然疫源性急性传染病。目前发现汉坦病毒有20多种血清型，在我国主要流行汉滩病毒（Hantaan virus，HT-NV）和汉城病毒（Seoul virus，SEOV）2种型别病毒。  相似文献   

重组逆转录病毒介导的neo^R基因在公鼠生殖系细胞的转移   总被引：1，自引：0，他引：1  

王凤阳  张守峰等 《中国兽医学报》2001,21(6):573-575

将感染滴度为10^6cfu/mL、携带新霉素磷酸转移酶Ⅱ（neo^R)基因的重组逆转录病毒与台盼蓝、polybrene按一定比例配制成注射液，单侧睾丸注入14－16日龄公鼠曲细精管以体内感染精原干细胞，进行重组逆转录病毒－精原干细胞介导的基因转移研究。注射后45d，采集公鼠精液，进行精液品质与PCR检测。结果表明，在优化的注射条件下，曲细精管内注射重组逆转录病毒后，不会干扰小鼠精子的正常发育能力，并能够将外源基因整合到精子基因组，从而首次通过重组逆转录病毒成功地实现了neo^R基因在公鼠生殖系细胞的转移。  相似文献   

非洲猪瘟病毒MGF505-3R蛋白的原核表达研究     

王凤杰  魏天  张芳毓  王成宇  张守峰  扈荣良  吕礼良  王永志 《吉林畜牧兽医》2022,43(1):1-2,5

为获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)体外诱导表达的MGF505-3R蛋白.实验依据GenBank中报道的MGF505-3R基因序列设计引物,引入His标签,以ASFV基因全序列为模板扩增目的基因.将目的基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,并转入大肠杆菌Transett...  相似文献   

一种改进的简单快速的多位点突变方法   总被引：2，自引：0，他引：2  

张守峰  扈荣良  夏咸柱 《中国兽医学报》2004,24(1):59-61

为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 ,也为其他类似研究提供了一种简单快速的突变方法  相似文献   

我国部分城乡犬狂犬病中和抗体水平调查   总被引：6，自引：0，他引：6  

张菲  刘晔  张守峰  曹亮  骆求辉  冯卫权  文武金  凌凤俊  李瑞达  石兴亚  扈荣良 《中国兽医学报》2006,26(6):634-636

以国际兽疫局(OIE)推荐的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对随机采自广东、河北、北京等地区的573份犬血清进行了狂犬病病毒中和抗体效价的测定,以确定犬群中狂犬病的免疫状况。结果显示,在不同地区或不同城市的动物防疫区域中,犬体内狂犬病病毒中和抗体平均水平存在着明显的差异,城市犬的中和抗体水平较高,有的中和抗体保护水平(0.5IU/mL)阳性率高达100%,少数则达不到保护水平,不同防疫区域狂犬病中和抗体水平为(0.08±0.03)~(4.39±1.45)IU/mL,平均保护水平阳性率为46.3%;乡村看家犬病毒中和抗体水平普遍较低,大部分犬体内无中和抗体,只有个别犬体内存在水平较低的中和抗体,平均保护水平阳性率为1.8%。  相似文献   

狂犬病病毒糖蛋白基因正向重组伪狂犬病病毒（疫苗株TK^-／gI^-）的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

袁子国  张秀香  李修明  王晓虎  高胜言  徐惠娟  张守峰  扈荣良 《中国兽医学报》2008,28(12)

构建以伪狂犬病病毒(PRV)为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组活载体疫苗。采用AseⅠ/MluⅠ切下EG-FP-rgp的表达盒,将其克隆入p8-AA载体的酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8-EGFP/rgp。将该质粒与PRV TK-/gI-基因组在质脂体介导下共转染PK-15细胞,获得PRV-EGFP/rgp重组病毒;通过噬斑克隆对其进行筛选、纯化,并通过RT-PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光对其进行鉴定,并对重组病毒的滴度、外源基因的遗传稳定性及其与亲本病毒株生长特性的关系进行了测定。结果表明:重组病毒的滴度(TCID50)为108.125/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;PRV-EGFP/rgp与亲本病毒PRV TK-/gI-生长趋势差异不显著。通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组PRV的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制提供了新的思路和方法。  相似文献   

伪狂犬病病毒TK-/gI-株PK基因转移载体的构建及LacZ基因表达     

袁子国  张秀香  刘全  高胜岩  徐慧娟  张守峰  刘晔  扈荣良 《中国兽医学报》2008,28(4)

伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TK-/gI-株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV(rPRV),且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性.通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TK-/gI-株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响.  相似文献