牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用   总被引：1，自引：1，他引：0  

季新成  牛国辉  员丽娟  张彦明  李鹏  段晓东  于学辉 《中国兽医学报》2010,30(6)

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。  相似文献   

太白蓼乙酸乙酯提取物的药效学研究     

张为民  张彦明  卿素珠  郭抗抗 《中国兽医学报》2010,30(10)

通过抗腹泻、抗炎、对免疫功能调节、体外抑菌和抗病毒等相关试验,研究了太白蓼乙酸乙酯提取物(PTKE)及PTKE柱层层析进一步分离物EB的药效学作用。结果表明,PTKE对蓖麻油和番泻叶所致的小鼠腹泻均有极显著的抑制作用(P0.01);对乙酸所致家兔肠黏膜毛细血管通透性增高有极显著抑制作用(P0.01),对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高及皮内注射二甲苯致皮肤毛细血管通透性增高也均有显著的抑制作用(P0.05);饮水中分别加入50、100、150 mg/kg的PTKE水溶液观察其对雏鸡免疫功能的影响,结果显示,在雏鸡生长的14～42日龄,各试验组雏鸡胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数与对照组相比差异显著或极显著(P0.05或P0.01);EB质量浓度为156μg/L时,其对脾脏、胸腺、法氏囊和外周血淋巴细胞的增殖显著高于细胞对照组(P0.01);PTKE和EB对临床分离鸡的2株大肠埃希菌和1株沙门菌具有一定的体外抑制作用;EB对新城疫病毒在鸡胚内增殖具有一定的抑制作用。以上结果提示,太白蓼提取物有明显的抗腹泻和抗炎作用,并能促进雏鸡免疫器官发育及淋巴细胞的增殖,具有一定的抑菌和抗病毒作用。  相似文献   

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

邢福珊  许信刚  童德文  王志昇  刘文静  宁蓬勃  张彦明 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2010,(3):1-6

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。  相似文献   

农村留守儿童监护制度的缺失及完善   总被引：1，自引：0，他引：1  

张彦明 《信阳农业高等专科学校学报》2010,20(3):69-71

留守儿童是指父母双方或一方外出务工半年以上,其子女留在家乡或托人照看未满18周岁的未成年人。以法律的形式明确监护人的权利和义务,规定非亲权监护人的报酬请求权,建立监护监督制度和留守儿童工作机制,是维护留守儿童合法权益的关键。  相似文献   

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立     

杨泽晓  庞歌  王印  姚学萍  张彦明  杨增岐  汪开毓  戴晓懿 《西北农业学报》2010,19(11):8-12

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。  相似文献   

副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞的黏附作用及其黏附模型的建立     

王津津  张彦明  汤智慧  唐青海  仝刚  郝艳阳 《西北农业学报》2010,19(6):23-28

为了探讨副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)与原代培养的猪气管黏膜上皮细胞的相互作用,应用气管支气管结扎灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞,于胶原覆盖的盖玻片上培养,使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上皮细胞,然后以对数生长期不同Hps含量的菌液感染上皮细胞和猪脐静脉血管内皮细胞,分别作用1、2、34、h后,通过革兰氏染色法观察Hps对细胞的黏附情况。结果表明,Hps可黏附在上皮细胞和内皮细胞表面;Hps对气管上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死和凋亡;Hps对细胞的黏附力与其在菌液中含量和作用时间有关,以菌落形成单位计,当含量为1.0×108mL-1且感染4 h后,黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量Hps黏附于猪气管上皮细胞,只有个别Hps黏附于猪血管内皮细胞表面。说明Hps对猪气管黏膜上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞,可以利用猪气管黏膜上皮细胞建立副猪嗜血杆菌的黏附细胞模型。  相似文献   

病毒载体研究进展     

田宏  刘湘涛  张彦明  林彤  吴锦艳  郑海学  龚真莉  谢庆阁 《动物医学进展》2005,26(9):4-7

外源基因进入细胞通常需要“运载工具”。在漫长的自然进化过程中,病毒是以寄生形式存活下来的最小、最简单的生命体,病毒分子生物学的发展为生物工程领域研究拓展了思路,提供了有效的方法和工具。重组病毒栽体又是当今病毒基因工程研究的热点之一,目前以动物病毒为基础设计的基因克隆及表达栽体主要有取代型的重组病毒栽体和重组的病毒一质粒栽体。文章对应用较广泛的病毒栽体做一综述。  相似文献   

我国近期7株猪瘟流行野毒E2基因变异研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

胡慧  邱昌庆  周继章  张彦明 《动物医学进展》2005,26(6):59-63

应用RT PCR 和nPCR 扩增了7 株国内近期(2001 年-2003 年)流行的猪瘟野毒E2 基因,分别克隆至pGEM T 载体并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与C 株、Alfort 株、Brecsia 株进行了同源性比较及遗传进化分析,构建了CS FV的遗传发生树,并对E2 结构与功能进行了分析。所测7株野毒均包括完整的信号肽序列及部分跨膜区在内的1 170 bp,与C株、Alfort株、Brescia 株核苷酸序列同源性分别为91.6%~94.5%、89.2%~92.7%、85.9%~89.3%,氨基酸同源性分别为91.2%~95.8%、88.9%~92.0%、84.0%~90.1%;而7株野毒之间的差异很小,其核苷酸序列同源性为95.8%~99.7%,氨基酸同源性为96.3%~99. 1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群,所测得7 株流行野毒均属于第1 群,而且可分为两亚群,与C 株在同一亚群。同时对主要抗原区氨基酸位点变异进行了分析,对其抗原决定簇的变异情况进行了推测。  相似文献   

犬转移因子对犬淋巴细胞体外增殖的影响   总被引：3，自引：2，他引：1  

常建军  孔庆波  丛丽媛  李佳  陈德坤  张彦明 《动物医学进展》2005,26(3):78-81

无菌采取犬抗凝血,分离并制备不同浓度外周血单个核细胞(PBMC)悬液。应用正交试验,测定植物血凝素,犊牛血清对不同浓度PBMC增殖的影响。用 MTT法测定不同浓度犬转移因子(TF)对 PBMC 增殖的影响。结果表明,当 PBMC 为 5×109 个/L,植物血凝素为 12. 5 mg/L, 犊牛血清为100 mL/L,PBMC 增殖效果最佳。TF 浓度在0.39 g/L~100 g/L时,对 PBMC转化增殖均有促进作用,在浓度为 1.56 g/L时促淋转效果最佳。且TF单独作用于 PBMC的效应明显优于PHA P的协同作用。TF对 PB MC有良好的刺激增殖效果。  相似文献   

"自杀性"DNA疫苗研究进展   总被引：2，自引：0，他引：2  

许信刚  张彦明 《动物医学进展》2004,25(6):24-28

核酸疫苗又称基因疫苗、DNA疫苗 ,是从基因治疗研究领域发展起来的一种全新的免疫防制剂。核酸疫苗具有许多优点 ,但是同时也有其不可避免的缺陷 ,这就使人们不得不把注意力集中在对传统的核酸疫苗进行改造以保持其优点 ,避免其缺陷上。“自杀性”DNA疫苗(suicidalDNAvaccine)就是基于常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗 (self replicatingRNAvaccine)基础上发展起来的一种新型疫苗 ,不仅具有常规DNA疫苗易制备、运输、保存等方面的优点 ,而且还有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与有效性 ,这使得其成为目前核酸疫苗研究的热点。文章就“自杀性”DNA疫苗的载体、构建、作用机理、优点以及研究现状作了综述  相似文献