伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达     

薛念波  方六荣  江云波  俞明敏  李彬  罗锐  陈焕春  肖少波 《中国兽医学报》2009,29(2)

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.  相似文献   

猪2型圆环病毒基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位     

宋云峰  金梅林  肖少波  方六荣陈焕春 《农业生物技术学报》2005,13(4)

  相似文献   

伪狂犬病根除计划     

陈焕春  金梅林  何启盖  吴斌  方六荣  吴美洲 《养殖与饲料．饲料世界》2003,(7):34-35

伪狂犬病是当今危害全球养猪业最严重的猪病,给养猪业造成了巨大的经济损失。西方发达国家大多在90年代相继制定和启动了该病的根除计划,并取得了很好的成效。该病在我国广泛存在并严重发病,损失巨大。“九五”期间我们承担了国家科技部中国生物工程开发中心生物技术攻关项目“伪狂犬病基因缺失疫苗研制”课题。经过五年的辛勤劳动,利用本室从我国华中地区发病猪病料分离鉴定筛选到抗原性和免疫原性强、在细胞上增殖滴度高的猪伪狂犬病毒鄂A株为亲本材料,成功研制出伪狂犬病毒gG—和gE—两  相似文献   

伪狂犬病病毒IE180基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达     

肖少波  方六荣  徐建祥  洪文洲  陈焕春 《中国兽医学报》2003,23(3):249-251

提取伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株基因组DNA,BamH I酶切后回收4.8kb左右的片段,克隆到pUC18中,酶切分析和部分序列测定筛选到含IE180基因的重组质粒pUCIE.进一步将长约1.8kb的IE180基因5′端部分编码区亚片段克隆到原核表达载体pET-28a中,使其置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合,重组表达质粒pET1.8转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量为62 000,同预期大小相当,并能同抗6×His的抗体发生特异性反应.  相似文献   

修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫   总被引：6，自引：0，他引：6  

江云波  方六荣  肖少波  牛传双  张辉  陈焕春 《中国兽医学报》2005,25(1):1-3

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上，进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCl-52M。间接免疫荧光证实体外表达后，免疫BALB／c小鼠，检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体，并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCl-52进行比较。结果表明，修饰后的DNA疫苗pCl-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCl-52，是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

马朝志  肖少波  宁娟  江云波  方六荣  陈焕春 《动物医学进展》2007,28(6):1-4

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.  相似文献   

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建     

李自力  陈焕春  徐高原  方六荣  肖少波  王祥  何启盖 《畜牧兽医学报》2007,38(1):53-58

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

伪狂犬病病毒鄂A株gC基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达   总被引：3，自引：0，他引：3  

肖少波  陈焕春  方六荣  洪文洲  何启盖  马相如 《中国农业科学》2002,35(2):202-206

 以伪狂犬病病毒国内地方分离株 (鄂A株 )为材料 ,采用核酸杂交、DNA重组技术直接从基因组DNA中克隆了最主要的保护性抗原基因gC ,测定了全序列并对其原核表达产物作为血清学诊断抗原进行了初步探讨。结果表明 :所克隆的 gC基因全长 175 5bp(含启动子序列和 poly(A)信号序列 ) ,具有典型I型膜蛋白结构特征。同具有代表性的国外标准株NIA 3株、IndianaS株相比 ,多个酶切点不同 ,尤其是具有分型意义的BamHI位点消失 ;氨基酸水平上也存在一定程度的差异 ,鄂A株 gC可编码 4 87个氨基酸残基 ,而以往所报道的gC均只编码 4 78或 4 79个氨基酸 ,有意义的是功能区突变较多 ,并存在连续 7个氨基酸残基的插入。同 pET 2 8a的 6xHis Tag融合的gC基因完整编码区在大肠杆菌中获得高效表达 ,融合蛋白分子量为 6 2ku ,能同伪狂犬病病毒高免血清发生特异性反应。纯化的表达产物作为ELISA和乳胶凝集诊断抗原 ,具有很高的敏感性和特异性  相似文献   

养猪场防制病毒性繁殖障碍病的免疫种序     

陈焕春  何启盖  吴斌  金梅林  方六荣  吴美洲 《养殖技术顾问》2002,(6):26

对我国规模化养猪的几种主要病毒性繁殖障碍病,即伪狂犬病、乙型脑炎、细小病毒感染、猪繁殖与呼吸障碍综合征等疫病的流行现状进行分析,制定出免疫程序(见表1),供同行参考.  相似文献   

伪狂犬病病毒gI/gE双缺失通用转移载体的构建与初步应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

方六荣  陈焕春  肖少波  马相如  王革非 《中国兽医学报》2003,23(1):4-6

对含伪狂犬病病毒（peudorabies virus,PRV)Ea株gI、gE、11K全基因，gD、28K基因部分编码区的质粒pSK4.5进行改造，消除其中的BamH1和Not1位点，将晚期基因gG的启动子、多克隆位点以及SV40poly(A)同时插入改造后的质粒pSKBN的Stu1和BstEⅡ位点，取代gI和gE的部分编码区，构建了由gG启动子驱动的gI/gE双缺失通用转移载体pgGIE-Uni。序列分析进一步证实，至少有8个单一酶切位点可供外源基因直接插入，上下游倒翼分别为0.8kb和2.4kb。将猪繁殖-呼吸障碍综合征（兰耳病）主要抗原基因ORF5插入pgGIE-Uni的BamHI和Not1位点之间，构建了含ORF5的转移质粒pgGIE-ORF5。上述结果为进一步研制猪伪狂犬病-兰耳病的2价基因工程疫苗奠定了基础。  相似文献