单核细胞增多性李斯特菌LMO1847基因在不同应激条件下的表达     

田国明  李肖梁  陈建舜  陈雪燕  方维焕 《畜牧与兽医》2007,39(7):7-11

根据GenBank登陆的单增李斯特菌标准株EGD序列设计引物,PCR扩增LM01847基因片段后插入表达载体pET-30 a,构建重组原核表达载体,并在E. coliBL21中成功表达。纯化目的蛋白制备多抗,ELISA结果显示:该蛋白多抗与单增李斯特菌全菌、全菌多抗与该蛋白均可发生反应。证明该蛋白在天然状态下存在于单增李斯特菌表面,且具有良好的免疫反应性。该蛋白在45℃、高盐、酸性环境中表达水平基本稳定,但在低pH值条件下反应活性消失;高盐或低温条件下,表达量随盐浓度的升高或温度的下降而降低。除4℃以外,该蛋白均能保持良好的免疫反应活性。本研究为建立针对该蛋白的李斯特菌免疫微球凝集、免疫磁珠分离等检测方法奠定基础。  相似文献   

猪瘟合并猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染   总被引：14，自引：5，他引：14  

杨宗照  方维焕 《中国兽医学报》2006,26(3):240-242

2004年初以来，杭州地区的几个规模化猪场陆续发生仔猪腹泻、保育猪呼吸困难的疾病，剖检见肺部呈橡皮样，全身淋巴结水肿，部分猪脾脏边缘梗死等，发病率、死亡率较高。设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的特异性引物，进行RT—PCR或PCR检测；运用伪狂犬病（PR）鉴别试剂盒检测PR，运用免疫荧光法检测猪瘟（HC），并进行了细菌分离培养，通过全面检查认为，这几个猪场发生了猪瘟合并猪PRRSV、PCV2感染。  相似文献   

兔病毒性出血症病毒中国株(JX/CHA/97)全基因组分子克隆及序列分析     

倪征  方维焕  张玉颖  云涛  陈锦清  刘光清 《中国预防兽医学报》2006,28(6):668-671,675

本研究首次完成了免病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）中国分离株JX／CHA／97全基因组序列的测定与分析。研究结果表明，JX／CHA／97株的全基因组由7437个核苷酸组成，其基因组构成为：5＇端有一个长度仅为9nt的非编码区，随后有2个阅读框架（ORFs）．分别编码一个聚合蛋白和一个结构蛋白。在基因组的3＇端也有一个非编码区，长度为59nt。另外，采用RACE方法获得了RHDV的poly（A）尾序，证明该结构至少含有27个A。根据RHDV衣壳蛋白的基因序列，将JX／CHA／97株与来自世界各地的22株RHDV分离株的基因组序列进行了比较与分析，并绘制了系统发生树。结果表明，RHDV各分离株之间存在较高的序列同源性，可以将它们至少分为6个拓朴群，提示RHDV有朝不同方向发生进化的趋势。  相似文献   

蜂王浆中氯霉素残留量的LC-MS/MS与ELISA检测方法研究     

谢文  张晓峰  方维焕  丁慧瑛  章晓氡  郑自强  奚君阳 《中国兽药杂志》2005,39(11):3-7

介绍了利用LC-MS/MS与ELISA方法快速、准确地测定蜂王浆中氯霉素残留量.前处理方法包括用酸沉淀蛋白、乙酸乙酯提取、自制硅胶柱、Oasis(HLB)小柱等净化步骤.同时,在LC-MS/MS测定方法中使用了同位素内标氯霉素-d5.建立的LC-MS/MS方法,多反应监测了氯霉素3对离子(321.0/256.9、321.0/194.0、321.0/175.8)和同位素内标氯霉素-d5 1对离子(326.0/157.1),检测低限为0.2μg/kg,线性范围为0.2～0.8μg/kg,加标回收率为97%～102%,RSD为1.9%～7.1%;ELISA方法检测低限为0.1μg/kg,该水平添加回收率为108.2%,RSD为12.2%.  相似文献   

猪链球菌2型三重PCR检测方法的建立   总被引：2，自引：1，他引：1  

陈健舜  李肖梁  田国明  马有智  方维焕 《中国兽医学报》2008,28(7)

针对猪链球菌2型gdh、mrp及cps2J基因设计3对引物,建立了该菌的三重PCR方法。30μL反应体系中3组引物gdh1、gdh2,mrp1、mrp2及cps2J1c、ps2J2的最适浓度比为1∶1∶1.67。最佳反应条件为94℃3 min;94℃1 min,55℃40 s,72℃50 s,30个循环;72℃5 min。可扩增到目的基因gdh、mrp及cps2J的片段大小分别为689、532和457 bp;猪链球菌2型BHI培养物的检测下限为450 CFU;猪肉人工污染样品经4 h增菌,其检测下限仅为4 500 CFU。以上结果显示,该三重PCR方法可用于组织样品和纯培养物中猪链球菌2型的检测,具有快速、特异和简便的特点。  相似文献   

两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

袁雪梅  陈宁  陈宇  王萍  童超  李得江  万婧  李肖梁  方维焕 《中国兽医寄生虫病》2010,18(3):66-72

根据猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）5端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法。灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。两种方法对猪瘟病毒C株的检测下限均为101TCID50,均高于常规的套式PCR。用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SYBR Green方法的检测下限为3×100copies,比TaqMan探针方法更加灵敏（3×101copies）。应用建立的SYBR Green方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSFV检测,有8份样品为阳性,与套式PCR方法检测结果一致。进一步应用SYBR Green方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。因此,本研究建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。  相似文献   

浙江及周边地区猪流行性腹泻病毒S基因分子特征分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

单颖  刘子琦  施杏芬  李国炜  陈聪  罗浩  刘亚杰  方维焕  李肖梁 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2018,(5)

对2013年4月至2017年4月间浙江省及周边24个地区共282份病料进行猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、轮状病毒A型(porcine group A rotavirus, GARV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCo V)和猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)等病原的检测,并选取其中的16份PEDV阳性样品进行S基因克隆和序列分析。结果显示:PEDV的检出率为64.89%(183/282),GARV为0.35%(1/282),PDCo V为4.25%(12/282),而未检出TGEV;PEDV在11月1日至次年4月1日间的累计检出率为74%,其余时间段的累计检出率为26%。对PEDV的S蛋白进行分子演化分析表明,PEDV可分为3个群,其中16份阳性样品均位于Ⅲ群,与疫苗毒株CV777、SM98和DR13株相比,核苷酸同源性为93.6%～95.2%,氨基酸同源性为92.4%～94.9%。16份PEDV阳性样品与中国PEDV的CV777疫苗毒株相比,形成了3个新的N-糖基化位点,破坏了1个N-糖基化位点。综上表明,当前仔猪腹泻主要病原为PEDV变异株,防控猪流行性腹泻需要注意季节的变化,也需要加快流行株疫苗的开发。  相似文献   

荧光法快速鉴定大肠杆菌的初步研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

施明华  方维焕 《浙江农业学报》1999,11(2):92-95

以４－甲基伞形胴酰－β－Ｄ葡糖醛酸苷为底物,将其结合于选择性固体培养基中,采用荧光法检测细菌是否产生特异性的β－葡糖苷酸酶作为鉴别细菌的依据。结果表明：大肠杆菌在脱氧胆酸钠培养基（ＤＯＣ培养基）中经３７℃培养９￣１１ｈ,其菌落在３６５ｎｍ波长紫外光激发下可产生明显的荧光,而其它几种常见的革兰氏阴性肠杆菌（志贺氏菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、柠檬杆菌和弧菌）和铜绿假单胞菌虽能在其中生长,但不产生荧光;在  相似文献   

猪Ⅲ型干扰素原核表达及其抗病毒效果研究     

陈韫陆  单颖  罗浩  徐计东  赵灵燕  方维焕  李肖梁 《浙江农业学报》2020,32(5):779

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P<0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P<0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。  相似文献   

宁波地区家犬狂犬病流行及免疫保护情况调查     

余全法  鲍伟华  王海霞  洪晓文  麻觉文  王芬露  方维焕 《中兽医医药杂志》2011,13(4):43-44

采用狂犬病抗体ELISA试剂,于2008、2009、2010年3年间,对宁波地区702份家犬血清进行跟踪检测。结果显示,宁波市家犬狂犬病综合抗体水平达到65.3%;在免疫后60 d与90 d时,总体抗体水平均保持在较高水平;宠物犬免疫抗体合格率优于农村犬;非免疫犬抗体检出率为15.3%,与近年来我市人的狂犬病发病率居高不下关系密切。  相似文献