CIAV VP1 C端基因片段克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引：3，自引：0，他引：3  

王英  王笑梅  高宏雷  付朝阳  张厚双  宋素泉  郭艳 《中国预防兽医学报》2004,26(6):432-435

将从组织病料中提取到的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到vp1基因,用DNAStar分析软件分析预测VP1的抗原表位,它们主要位于VP1氨基酸序列的第1～95、134～303、327～435位,分别命名为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区.欲表达C端基因片段,含部分Ⅱ区和完整的Ⅲ区.把vp1基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,用BamHI消化重组表达质粒pGEX-vp1,回收含C端基因的大片段,自连转化大肠杆菌感受态细胞,得到重组质粒pGEX-vp1(C).重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果VP1 C端基因片段在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为49kDa.蛋白纯化后作ELISA检测,可与阳性血清反应.本研究为研制应用重组抗原制备ELISA诊断试剂盒奠定了基础.  相似文献   

传染性法氏囊病病毒Gt株基因组A节段的克隆和序列分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

张厚双  包晓玮  王笑梅  高宏雷  付朝阳  彭志伟  鞠玉琳 《中国预防兽医学报》2005,27(2):130-133,138

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV-Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,使其成为弱毒株IBDV-Gt.从细胞适应毒中提取病毒dsRNA,通过反转录,使用Long-accurate PCR(LA-PCR)用一对引物一步直接扩增IBDV-Gt基因组A节段全长cDNA的方法,得到一约3.30kb的片段.测序结果证明已获得3255bp的A节段全长,对vvIBDV-Gx株和IBDV-Gt株的全部核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明IBDV-Gt株与国内外数株IBDV弱毒株的同源性在99%以上.  相似文献   

J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立   总被引：5，自引：0，他引：5  

郭艳  付朝阳  宋素泉  高宏雷  王笑梅  王英  张厚双  王晓艳  胡建民 《中国预防兽医学报》2005,27(4):304-307

本研究分离纯化了具有反应活性的J亚群禽白血病JL-2株gp85表达蛋白,并以其为抗原,开展了相关反应条件、特异性、重复性、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究,初步建立了J亚群禽白血病ELISA诊断方法.  相似文献   

表达传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免？…   总被引：3，自引：0，他引：3  

沈瑞忠  王笑梅 《中国畜禽传染病》1998,20(2):65-67

以脂质体转染技术构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２基因的重组鸡痘病毒ＦＰＶ－ＶＰ２,该病毒性在鸡胚成纤维细胞及鸡体内均能稳定产生子代病毒,经翅皮下５×１０＾５ＰＦＵ／羽免疫１日龄ＳＰＦ鸡,免疫后４周以１００ＬＤ５０／羽ＩＢＤＶ超强毒株Ｇ株攻毒,获得了５／６的保护,但不能有效预防临床发病及法氏囊受损萎缩,实验结果证明了ＶＰ２是ＩＢＤＶ的宿主保护性抗原,提示Ｔ细胞介导的免疫可能在ＩＢＤＶ  相似文献   

鸡传染性腔上囊病病毒Gt株全基因组序列分析及真核表达载体的构建     

祁小乐高玉龙  高宏雷邓小芸 张宁王晓燕  王笑梅 《中国兽医科技》2006,36(10):820-826

采用一步法长距离RT-PCR克隆了IBDV Gt株全基因组，对其核苷酸和氨基酸序列进行了系统分析。在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签，且在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz）。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的口肌动蛋白启动子下游，构建了IBDV真核表达载体pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，为IBDV新型高效拯救平台的构建及基于此的病毒基因功能奠定了基础。  相似文献   

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP3基因的克隆与原核表达   总被引：3，自引：0，他引：3  

彭志伟  王笑梅  高宏雷  付朝阳  张厚双  包晓玮  冉多良 《中国预防兽医学报》2006,28(2):124-127

利用PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因，将其克隆到表达载体pPRO^EX-HTa中，获得重组质粒命名为VP3／PA，经PCR、酶切和序列分析鉴定表明，插入的位置、大小和读码框均正确。SDS—PAGE检测表明，经重组质粒VP3／PA转化、诱导的受体菌E．coli DH5 α能表达结构蛋白VP3基因，约33 Ku，表达量达到了茵体总蛋白的33．9％，经Western blot等检测表明，诱导表达的抗原蛋白能与vvIBDV阳性血清发生特异性反应。这为IBDV血清学诊断方法的建立打下了基础。  相似文献   

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建   总被引：2，自引：0，他引：2  

包晓玮  王笑梅  高宏雷  祁小乐  付朝阳  张厚双  彭志伟 《中国预防兽医学报》2006,28(4):369-374

本研究以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5'端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入pMD18-T载体,构建成pMD-A、pMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录,然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代。收获的细胞传代培养物分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果表明蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。  相似文献   

鸡贫血病—法氏囊病疫苗免疫母鸡后子代雏鸡的免疫学变化   总被引：2，自引：0，他引：2  

郑世民  甄荣  葛铭  胡守萍  张瑞莉  王笑梅  王秀荣 《中国兽医杂志》2001,37(12):10-13

本项目应用现代免疫学新技术对鸡传染性贫血病（CIA）-传染性法氏囊病（IBD）疫苗联合免疫母鸡后,其子代雏鸡外周血液T、B细胞数量和IgG、IgM、IgA含量法及法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体、哈德尔腺的T细胞和IgG、IgM、IgA抗体生成细胞数量以及泪液、气管液、胆汁、肠液的IgA、IgM、IgG含量的变化进行了动态研究。结果发现,CIA-IBD疫苗联合免疫母鸡后,其子代雏鸡外周血液、免疫器官组织和局部体液的上述各项指标均不同程度地高于未免疫的相应对照雏鸡。表明CIA-IBD疫苗免疫母鸡后,其子代雏鸡的体液免疫和细胞免疫功能明显增强,而CIAV-IBDV强毒攻击后,未免疫的子代雏鸡,其外周血液,免疫器官组织和局部体液的各项免疫学指标均明显低于疫苗免疫攻毒的子代雏鸡,这与未免疫雏鸡缺乏特异性抗体,强毒攻击后,雏鸡免疫器官组织广泛损害,淋巴细胞变性坏死等有关。  相似文献   

传染性法氏囊病病毒超强毒株致弱的分子生物学特征   总被引：2，自引：0，他引：2  

许信刚  王笑梅  李健强  童光志 《西北农业学报》2000,9(3):12-15,22

为了探索传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）超强毒株致弱的分子特征变化,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）及其不同代次细胞传代致弱毒中扩增到编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ高变区基因,并对其序列测定。将ｖｖＩＢＤＶ及其致弱毒株ＶＰ２高变区的氨基酸与其它血清Ⅰ型毒株比较,发现ｖｖＩＢＤＶ与其致弱毒株在ＶＰ２高变区的２２２、２４２、２５３、２５６、２７１、２７９、２８４、２９４、２９９和３００位氨基酸发  相似文献   

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建     

许信刚  李健强  王笑梅 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2000,28(5):54-60

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础  相似文献