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将鸡胸腺和腔上囊淋巴组织剪碎后与PBS磷酸盐缓冲液混合，通过密度梯度离心和尼龙棉柱过滤对T、B淋巴细胞进行了分离纯化。纯化的T、B淋巴细胞以FITC标记的鼠抗鸡CD4单抗，RPE标记的鼠抗鸡CD8单抗，FITC标记的鼠抗鸡Bu-1单抗染色，用流式细胞仪分类检测其纯度，用台盼蓝排斥试验检测T、B淋巴细胞的活力。结果表明，以本研究建立的方法分离到的T、B淋巴细胞纯度较高（均达90％以上），细胞活力强，与流式细胞仪分选的效果相当，且经济简便。 相似文献
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为制备禽白血病病毒(ALV)核衣壳蛋白p27的单克隆抗体,本研究以原核表达的融合蛋白GST-ALV p27免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA进行筛选,制备了5株能够稳定传代并分泌抗p27单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5D3、4F12、5B10、1C5和3C6,亚类鉴定3C6为IgG2b,其余为IgG1.通过IFA、Western-blot及竞争抑制ELISA,表明该5株单抗与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)呈阳性反应,而与其他常见禽源病毒无交叉反应.利用5D3和4F12单抗建立了双抗体夹心ELISA方法,经663份临床样本验证,该方法与商品化试剂盒的符合率达到95.17％,证明所研制的针对ALV p27蛋白的单抗及建立的双抗体ELISA方法具有较高的应用价值. 相似文献
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为了制备鸡干扰素调节因子7(interferon regulatory fator 7,IRF7)抗体,本研究通过分离鸡的外周血淋巴细胞,抽提RNA并反转录获得鸡淋巴细胞c DNA,利用聚合酶链式反应扩增获得鸡IRF7基因(ch IRF7),将该基因克隆入原核表达载体p COLD-TF中,构建成p COLD-TF-ch IRF7原核表达质粒。将测序正确的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经0.25 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导20 h。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得高效表达,大小为107 k Da。切胶免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗鸡IRF7多克隆抗体。激光共聚焦、Western blot实验结果显示,该抗鸡IRF7多克隆抗体能与真核质粒表达的ch IRF7蛋白发生特异性反应。该抗体的成功制备为进一步研究鸡IRF7的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
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禽致病性大肠杆菌中四种抗氨基糖苷类药物耐药基因的分子流行病学调查 总被引：3，自引：0，他引：3
氨基糖苷类药物曾经是临床最为常用而有效的抗生素,长期应用与不合理使用使得该药物效果不尽理想。本研究参照GenBank中耐药基因相关序列,设计引物,结果从禽源大肠杆菌基因组中扩增出4种抗氨基糖苷类药物基因aadA1、strA、strB、aph(3′),经pGEX-T-easy和pET32a载体克隆和序列分析,证明扩增获得的基因序列与GenBank中参考序列同源性达到97%以上。对分离保存的216株禽致病性大肠杆菌进行氨基糖苷类药物耐药基因的分子流行病学检测,结果表明:aadA1阳性率高达49.1%,strA和strB的阳性率分别为56%和65.7%,aph(3′)的阳性率为16.2%;近三分之二的被检菌株携带有2种以上氨基糖苷类药物耐药基因。药敏试验结果显示所有被检菌株对链霉素耐药率为68.9%,而对阿米卡星的耐药率为38.9%。本研究结果说明禽类细菌的耐药性与相关耐药基因的检出率基本呈正相关,临床日益严重的耐药现象与耐药基因的普遍存在有着很大的关系,提示控制禽源耐药细菌对人类健康与卫生安全有重要意义。 相似文献
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本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)检测方法,并对REV在鸡胚成纤维细胞(chick embryo fi broblast,CEF)上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计3对引物,利用重组质粒作为模板,绘制3种不同基因的标准曲线。检测结果显示,本研究建立了多重实时荧光PCR检测方法,所制备的标准品模板在108~101copies范围内与Ct值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷贝数均先减少后增多。通过实时荧光PCR技术与间接免疫荧光方法检测,发现REV在CEF上复制的初始阶段呈现病毒适应过程,此后病毒大量复制,表现出明显的增长趋势。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法,同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。 相似文献
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研究首先对血清8型禽腺病毒(FAd V-8)的纤突蛋白基因F进行了克隆并分别构建了原核表达载体和真核表达载体,经测序验证后分别命名为p GEX-6P-1-F和pc DNA3.1-F。将原核表达质粒pGEX-6P-1-F转化BL21,经IPTG诱导,获得了FAd V-8 F蛋白的GST-F可溶性融合表达产物。将纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体。Western blot结果证明,制备的抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体能特异性地识别转染pc DNA3.1-F或感染FAd V-8病毒细胞中57 ku大小的蛋白条带。间接免疫荧光试验同样证明,抗FAd V-8的F蛋白的多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。研究结果为进一步建立FAd V-8快速血清学诊断方法、亚单位疫苗研制及探究纤突蛋白F在病毒感染致病中作用奠定了基础。 相似文献
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雏鸡是鸡传染性贫血病毒（Chickenanemiavirus,CAV）的最易感宿主。为系统了解中国国内CAV海安分离株（HA9805）感染雏鸡后的病原动态及与血清学和致病性的关系,本研究对1日龄SPF鸡进行了人工感染实验,感染后不同时间进行样品采集,并用病毒学、血清学以及组织病理学方法进行了检测与分析。研究结果发现,CAV海安分离株（HA9805）通过胸肌接种可引发雏鸡CAV病毒血症,引起CAV特征性临床症状及病理变化,并导致雏鸡高达13．3％的死亡率;血清中CAV核酸以及中和抗体的产生与组织病理变化以及疾病进程密切相关。该结果为CAV的早期诊断,制定有效的预防与控制措施提供了科学依据。 相似文献
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本研究首先利用同源重组一步克隆法将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)的VP3基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体上,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析成功获得了重组蛋白rGST-VP3的表达.随即以纯化的重组蛋白rGST-VP3免疫Balb/c小鼠,通过脾细胞与SP2/0细胞融合以及间接免疫荧光(IFA)筛选,获得2株稳定分泌CIAV-VP3抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8;亚型鉴定表明,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均为IgG1;效价测定发现,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1:102400与1:12800;Western blot进一步证实,CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别重组蛋白rGST-VP3.本研究结果为后期研究VP3蛋白在CIAV致病中作用及其诱导凋亡分子机制奠定了坚实的物质基础. 相似文献
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禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
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鹧鸪鸡伤寒沙门氏菌感染的诊断与治疗 总被引：3，自引：0，他引：3
某鹧鸪养殖场饲养10000只鹧鸪，240日龄发病，临床症状表现为病鹧鸪采食量突然下降，精神不振、羽毛蓬松杂乱、粪便呈稀白色，病程持续近一个月，死亡鹧鸪约200只。共送检30只，剖检病理变化主要为肝肿大、质地极脆易破裂，其中60％肝呈土黄色，20％血液稀薄，80％盲肠内有硬泥块样物质，20％眼周皮下水肿，30％肾肿大、有出血，30％泄殖腔有白色粪便。根据病史调查、症状观察、病理剖析、细菌分离以及染色镜检、生化试验、血清型鉴定一系列试验，诊断为由鸡伤寒沙门氏菌感染所引起的细菌性疾病。同时根据药敏试验结果对发病群进行治疗，使病情得到迅速控制，为该病的防治积累了一定的经验。 相似文献