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参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒（FMDV）全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对1株Asia1型（简称As01）FMDV进行分段克隆及序列测定,将测序结果利用软件进行拼接。结果表明,该毒株的FMDV基因组[不合poly（C）]全长8180nt,其中编码区为6987nt,5’和3’非编码区（UTR）分别为1078nt和95nt,3＇UTR之后为20nt的poly（A）尾巴。将As01株与其他FMDV参考毒株利用分子生物学软件进行多序列比对分析表明,As01株与Asia 1／Jiangsu／China／2005、Asia 1／Isr 1／3／63、ZB／CHA／58等Asia 1型FMDV遗传进化关系较为密切,而与O型和A型FMDV遗传关系较远。 相似文献
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本研究旨在获得牛副流感病毒3型（BPIV3）的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板，利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶（HN）的基因片段，然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段（HNex基因），并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中，经双酶切连接至pET-30a（+）表达载体中，构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex，转化大肠杆菌RosettaTM（DE3）pLysS感受态细胞，IPTG诱导后，用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原，制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示，本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明，53 ku处有特异条带出现，并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1：819 200。Western blotting结果表明，制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之，本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白，并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体，为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。 相似文献
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为研究牛Ⅰ型干扰素受体α链（IFNAR1）与其配体结合的生物学性质，本研究采用RT-PCR方法从感染水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的犊牛原代肾细胞中扩增得到IFNAR1基因，然后构建了表达BoIFNAR1胞外区多肽（BoIFNAR1-EC）的原核表达载体pET30a-BoIFNAR1-EC，在RosettaTM（DE3）pLysS宿主菌中表达出重组蛋白rBoIFNAR1-EC，并以纯化后的rBoIFNAR1-EC作为免疫原制备兔抗牛IFNAR1的多克隆抗体，随后鉴定BoIFNAR1与其配体的结合活性。结果表明，试验成功克隆得到1 685 bp的牛IFNAR1基因，编码560个氨基酸，由24个氨基酸组成的信号肽、414个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区及99个氨基酸组成的胞内区组成，与其他物种IFNAR1氨基酸序列同源性为63%~91%，在进化上具有高度保守性，其与羊的亲缘关系最近。随后构建了含牛IFNAR1胞外区基因的重组表达载体，并诱导表达了重组牛IFNAR1胞外区蛋白rBoIFNAR1-EC，其在大肠杆菌中几乎全部为可溶性表达，经纯化透析后作为免疫原制备了兔抗牛IFNAR1的特异性抗体，抗体效价高达1：204 800。配体结合试验表明，牛IFNAR1重组蛋白可与牛IFN-αA和IFN-ε结合，其多克隆抗体可阻断牛IFN-αA和IFN-ε与细胞表面的IFNAR1特异性结合，进而阻断牛IFN-αA和IFN-ε的抗病毒信号传导。 相似文献
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为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。 相似文献
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为了解东北地区牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)的流行情况,本研究采用间接ELISA试验与套式RT-PCR分型检测方法对东北地区19个规模化奶牛场的1 198份血清进行了BVDV的抗体与核酸检测.结果表明,BVDV在东北地区呈散发性流行,抗体阳性率为23.5％,各奶牛场抗体阳性率在0～40％之间;BVDV核酸阳性的奶牛场均包括在抗体阳性的奶牛场中,并且均为BVDV Ⅰ型.结果提示,东北地区大部分奶牛场中存在BVDV污染,并且可能存在有持续性感染牛,应采取相应的净化措施对该病进行控制. 相似文献
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拟制备鸭肠炎病毒(DEV)gB抗原优势区的多克隆抗体,初步应用于该病毒的检测。以本实验室克隆的DEVC-KCE株ul27基因序列为参考序列设计特异性引物,通过PCR获得DEV gB优势表位区域基因片段gB-AD(331—570bp),并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导获得与预期大小相符的重组蛋白质,以Ni-NTA柱亲和层析法纯化重组蛋白质,利用DEV阳性血清检测重组蛋白质的抗原性,并用切胶纯化的重组蛋白质免疫家兔,制备兔抗DEV gB-AD血清。结果显示,重组蛋白质可被DEV阳性血清特异性识别,制备的兔源多克隆抗体I-ELISA效价为1∶10 240,且其具有中和活性;兔源多克隆抗体在还原电泳条件下显示DEV gB的相对分子质量约为66ku,而在非还原电泳条件下DEV gB显示为相对分子质量约120和66ku的两条目的带,通过间接免疫荧光试验和中和试验进一步证实制备的兔源多克隆抗体可特异性识别鸭肠炎病毒感染细胞所合成的gB蛋白。结果表明,所制备的兔抗DEV gB-AD多克隆抗体可作为检测DEV的试剂,为DEV检测及gB的功能研究提供必要的基础数据和材料。 相似文献
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布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析 总被引：1，自引：0，他引：1
布鲁氏菌病严重阻碍我国养牛业的健康发展,控制乃至根除布病是世界范围内各布病负担国的共识。本文就各种布鲁氏菌病实验室诊断技术及其在布病净化程序中的适用性加以客观评述,谨供布病防控工作者参考。 相似文献
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牛IL-2重组质粒对口蹄疫病毒G-H环多肽免疫小鼠的佐剂效应 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验目的是研究牛IL-2重组质粒对口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)G-H环多肽免疫小鼠的佐剂效应.作者构建了含有信号肽序列的牛IL-2真核表达质粒pcDNA3.1-pBoIL-2,并体外鉴定其表达,同时原核表达并纯化了Asial型FMDV G-H环多肽.采用不同组合的pcDNA3.1-pBoIL-2、FMDV G-H环多肽分组免疫小鼠,并设阴、阳性对照,通过间接ELISA试验、微量血清中和试验、淋巴细胞增殖试验和实时定量PCR试验对各免疫组小鼠体液和细胞免疫水平进行综合评价.结果表明,与G-H+pcDNA3.1免疫组比较,G-H+pcD-NA3.1-pBoIL-2免疫组特异性抗体水平、中和抗体滴度、淋巴细胞增殖水平和细胞因子相对表达水平显著提高(P<0.05).结果提示,牛IL-2真核表达质粒可以显著提高G-H环多肽的免疫效果. 相似文献
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