广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析     

黄雯晶  梁国智  梅敏敏  李晓文  黄淑坚 《中国畜牧兽医》2017,44(2):327-335

为研究广东新型呼肠孤病毒（NDRV）的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。  相似文献   

一株猪伪狂犬病病毒的主要毒力相关基因的变异分析及其对家兔的致病性     

袁生  李安琪  吕文珂  羊露露  周峰  黄良宗  白挨泉  温峰  黄淑坚  郭锦玥 《畜牧兽医学报》2023,(5):2195-2199

旨在了解目前广东省伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)流行变异情况，本研究采集了2020年广东省佛山市某规模化养猪场疑似PRV感染的病猪血液样本，接种PK-15细胞后，运用透射电镜和间接免疫荧光方法鉴定为PRV,并将其命名为GDFS2020株；分析主要毒力基因gB、gC、gD、gE和TK编码氨基酸序列进行分子特征及遗传进化分析，结果显示，该毒株为国内变异株，但有个别氨基酸位点发生了突变；家兔致病性试验结果表明，接种组家兔肝边缘有梗死，心、脾、肾及脑组织均有充血、肿大和淤血等病变；病理组织切片结果显示，脑组织神经元变性萎缩，核略微皱缩，空隙增多变大等明显的病理变化。以上结果表明，本试验成功分离了1株PRV变异株，并对家兔具有较强致病性，为广东省PRV流行病学研究及遗传进化提供了参考数据。  相似文献   

新型鸭呼肠孤病毒可视化检测方法的建立与应用     

蔡跃佳  梁国智  梅敏敏  黄雯晶  李晓文  李文锋  黄淑坚  李智丽 《黑龙江畜牧兽医》2019,(7)

为了快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),试验针对NDRV保守序列设计特异性引物,将RT-LAMP技术与荧光染料钙黄绿素结合,建立NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法,并对该方法的反应温度、时间及体系进行优化,检测该方法的特异性和敏感性,同时采集12份临床疑似NDRV感染的病料分别用钙黄绿素可视化RT-LAMP方法和常规RT-PCR方法进行检测,比较两者的阳性检出率。结果表明:成功构建NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法;优化后的反应温度为66℃,反应时间为50 min,反应体系中Mg~(2+)浓度为3.0 mmol/L,甜菜碱浓度为0.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,Bst DNA聚合酶的浓度为0.32 U/μL,AMV反转录酶的浓度为0.14 U/μL,内外引物浓度比为10∶1,环外引物浓度比为4∶1。该方法可特异性检测出NDRV;对NDRV的最低检测量约为200 fg;用该方法对临床疑似NDRV感染的病料进行检测,阳性率为91.67%,而常规RT-PCR方法阳性率为83.33%,并且钙黄绿素可视化RT-LAMP方法能通过颜色变化观察反应结果。说明试验建立的RT-LAMP检测方法特异性好,敏感性强,读取结果更方便直观。  相似文献   

一例禽白血病的诊断     

王美红  黄雯晶  李文锋  傅禹铭  李晓文  郭锦玥  张雪莲  黄淑坚  李智丽 《黑龙江畜牧兽医》2019,(12)

为了对广东某麻黄种鸡场疑似禽白血病的患鸡进行确诊,试验采用了剖检、反转录PCR(RTPCR)、病理组织切片观察等方法进行诊断。结果表明:患鸡剖检可见皮下、心脏、肾脏、肺脏、胰腺均出现不同程度的灰白色肿瘤结节,肝脏、脾脏、肾脏严重肿大,质地变硬,颜色变淡;随机收集该场5只疑似病鸡的病料进行PCR检测,4只病鸡的病料可扩增出目的条带;采集病鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏、脑、肠进行病理组织切片观察,内脏器官和软骨组织的骨化部分中含有数量不等的髓细胞样瘤细胞,呈单个散在或局灶样分布,大脑有单个散在的髓细胞样瘤细胞出现,小脑组织轻度水肿。综合以上结果确诊该鸡场病鸡所患疾病为禽白血病。  相似文献   

新型鸭呼肠孤病毒QY株σB蛋白基因特征、二级结构预测及其细胞抗原表位分析     

吴阳开  范文胜  张雪莲  李智丽  郭锦玥  李文锋  黄淑坚 《中国畜牧兽医》2019,46(10):2851-2859

本研究旨在对新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）QY株σB蛋白的遗传变异规律和结构及功能进行分析。从GenBank数据库中获取QY株和25株参考株的σB蛋白编码序列,通过Mega 6.0软件进行序列比对分析和系统进化树构建;使用Datamonkey软件进行选择压力分析;运用生物信息学软件预测QY株σB蛋白二级结构功能及B细胞和T细胞抗原表位。相似性分析结果显示,NDRV QY株与国内其他地区分离的鸭呼肠孤病毒（DRV）氨基酸相似性达到94.9%~98.9%,与禽呼肠孤病毒（ARV）及番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的相似性仅为66.5%~68.4%和67.6%~68.4%;选择压力分析显示,σB蛋白承受净化选择压力,但存在一个正向选择位点;σB蛋白属于亲水蛋白,不具有信号肽和跨膜区,含有潜在的O-糖基化位点;结构预测分析显示,σB蛋白具有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲等丰富的二级结构;表位分析显示,σB蛋白含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位。本研究成功进行了QY株σB蛋白的基因特征和结构功能预测及其细胞表位分析,为深入了解该蛋白的免疫学特性及研发NDRV新型疫苗奠定了基础。  相似文献   

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达     

李文锋  梅敏敏  黄兴国  黄雯晶  李晓文  Saeed El-Ashram  黄淑坚  李智丽 《中国畜牧兽医》2018,45(10):2700-2706

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒（new-type duck reovirus,NDRV）XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a（+）质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a（+）-sσB,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3 h、32℃和0.25 mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni²⁺柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRV σB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。  相似文献   

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立     

黄淑坚  龚中贵  陈秀玲  梁小英  冼琼珍  马春全  王林川  辛朝安 《畜牧兽医杂志》2007,26(2):1-3

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段、大小分别为490 bp和686 bp;该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速,敏感特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。  相似文献   

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备     

杨景  张新宇  梁志鹏  程晴  王聪颖  池仕红  袁生  郭锦玥  黄淑坚  温峰 《中国畜牧兽医》2022,49(10):3963-3971

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。  相似文献   

养鸡场综合防疫措施的建立     

龚中贵  邓理主  甘汉均  黄淑坚  王林川 《中国禽业导刊》2011,(9):45-45

生物安全是集约化养殖一项疫病控制系统工程，本文针对规模化家禽养殖生产关于生物安全综合防疫措施的建立，分以下几个方面阐述。  相似文献   

种鸭混合感染致病性大肠杆菌和链球菌     

罗立新  黄淑坚  吕宗吉 《养禽与禽病防治》1996,(8)

某种鸭场在1996年1～2月期间,发现有一群鸭陆续死亡,其中以种母鸭的死亡为主,接着多群种母鸭相继出现减蛋,现将病鸭的临诊症状、病理变化、病原分离培养、生化试验及动物致病性试验等情况报道如下。 一、临诊症状:病鸭主要表现精神沉郁,昏睡,腹部膨大下垂。 二.病理变化:所有的病鸭都有气囊炎、卵子变形、变色、变性和卵黄性腹膜炎,其中大部分病鸭有肝周炎、肝硬化和大量的腹水,只有个别病鸭有纤维素性肝周炎和纤维素性心包炎。  相似文献