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抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。 相似文献
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2001～2003年,在岷县寺沟乡奔直寺对美国红三叶、加拿大红三叶、岷山红三叶进行引种对比试验.结果表明岷山红三叶比美国红三叶生育期短35 d、比加拿大红三叶生育期短45 d;现蕾期平均株高岷山红三叶为95.8 cm,比美国红三叶(株高90.4 cm)高5.4 cm、比加拿大红三叶(株高90.1 cm)高5.7 cm;全年鲜草产量岷山红三叶为70 995 kg/hm2,比美国红三叶(53 970 kg/m2)高17 025 kg/hm2,是美国红三叶鲜草产量的1.32倍;比加拿大红三叶(41 475 kg/hm2)高29 520 kg/hm2,是加拿大红三叶鲜草产量的1.71倍,差异极显著(p＜0.01).说明岷山红三叶更适宜在高寒阴湿地区种植. 相似文献
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设置青贮燕麦与青贮苜蓿的质量比分别为1∶0(A组)、7∶3(B组)、1∶1(C组)、3∶7(D组)、0∶1(E组)的5组混合饲草,研究不同比例的混合饲草对羔羊育肥效果的影响,筛选适宜的饲草搭配比例。结果:青贮燕麦与青贮苜蓿混合饲喂育肥羔羊,均有较好的育肥效果,羔羊的采食量显著增加,但综合采食量、增重和经济效益等指标,认为D组是青贮燕麦与青贮苜蓿混合饲草组合中的最佳组合,只均日增重0.184 kg,经济效益159.08元,较饲喂裹包青贮燕麦A组的0.123 kg、53.68元分别增加49.59%、105.4元,较饲喂裹包青贮苜蓿E组的0.161kg、120.81元分别增加14.29%、38.27元。 相似文献
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柑橘是湖南省主要经济作物,栽培种类较多,其中甜橙类在近年来发展较快。本研究针对目前柑橘生产中存在的施肥问题,采用定点采样分析的方法对湖南甜橙主产区部分柑橘园的土壤、叶片和果实的矿质元素进行了全面分析,以期为柑橘营养诊断和合理施肥提供科学依据。本研究对湖南甜橙主产区的洪江、麻阳、永兴、宜章4个县市共计39个果园进行土壤、叶片以及果实样品进行了矿质元素的测定,同时还分析了土壤有机质、pH和养分状况,然后与柑橘营养诊断标准进行了比较,确定了主产区甜橙园土壤和树体的养分丰缺情况。湖南省甜橙主产区柑橘园土壤pH偏低,84.6%的果园土壤pH低于4.8;大部分果园有机质含量处于2%-3%,仅两个果园有机质含量低于2%;调查的39个橘园土壤N、P、K缺乏比例分别为碱解氮100%、41.1%、15.4%,中量元素Ca、Mg缺乏比例分别为64.1%、69.2%,微量元素Zn、B缺乏比例为5.1%、82.1%,Fe、Mn、Cu、Mo过量比例分别为89.7%、3.8%、76.9%、23.1%;叶片养分缺乏比例分别为氮：100%,钾：2.6%,钙：84.5%,镁：89.7%,锌：53.8%,硼：64.1%,磷和钼不缺乏,铁、铜、锰多数超量,少数缺乏。针对湖南甜橙主产区的土壤偏酸性的现状,需要加强施用碱性肥料和中量元素肥料,如钙镁磷肥等,也可以采用撒石灰石来调节pH;根据土壤养分现状;针对铁、铜、锰微量元素过量的情况,要减少含铁、铜、锰元素肥料的施用,部分果园需要适当补充锌和硼肥。 相似文献
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以枸橼C-05叶片为材料,对枸橼C-05中HSP23.3基因的ORF进行了克隆,并对其生物学信息进行了分析。结果显示：HSP23.3基因在枸橼C-05中的ORF为615 bp,编码204个氨基酸。枸橼C-05的HSP23.3蛋白属于跨膜亲水不稳定蛋白,预测定位于细胞质,二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲构成,其中,α-螺旋和无规则卷曲是其最主要的二级结构元件,且三级结构和二级结构预测结果高度相似。不同物种同源序列进化分析结果显示枸橼C-05的HSP23.3与漾濞槭的TXG74 151.1亲缘关系最近。含枸橼C-05种质HSP23.3基因的转基因拟南芥T2代株系接种丁香假单胞菌结果显示转基因拟南芥与野生型相比症状较轻且能抑制丁香假单胞菌的繁殖。本研究初步认为HSP23.3基因可能参与枸橼C-05抗溃疡病反应过程。 相似文献
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为探究HSP20在柑橘（Citrus L.）响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中发挥的作用，鉴定CsHSP20家族基因。生物学信息分析显示共有42个，分为11个亚族，分布在9条染色体上，编码135～373个氨基酸，蛋白分子量15.17～41.71 kD，等电点4.53～10.07,92.9%的基因没有或只有1个内含子，各亚族基因间有高度相似的结构和保守基序，每个基因的启动子都具有与激素或胁迫相关的顺式作用元件。其次，对感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05进行接种Xcc和40℃热胁迫处理，qRT-PCR结果显示CsHSP20家族中的HSP17.9、HSP23.3、HSP18.5和HSP18.0均上调表达，但抗感材料之间差异明显，HSP23.3在枸橼C-05中受Xcc上调表达水平极显著，该结果与受Xcc侵染的转录组结果一致。在冰糖橙叶片瞬时超表达候选基因，Xcc定量分析结果显示枸橼C-05的HSP23.3抑制Xcc繁殖速度更明显。 相似文献
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柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染感病种质冰糖橙叶片后，在侵染部位形成典型的火山口凸起症状，但在抗病种质枸橼C-05叶片侵染部位呈现逐渐褐色坏死，未形成溃疡病典型症状。基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果，分析鉴定的20个甜橙SWEET受Xcc诱导表达变化，结果显示SWEET2a和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导上调表达，SWEET12b在枸橼C-05中受Xcc诱导上调表达；实时荧光定量PCR验证，SWEET2a在冰糖橙叶片中受Xcc诱导高表达而在枸橼C-05叶片中表达变化不显著；SWEET2a在不同柑橘种质同源基因编码的氨基酸序列相似性为94.6%，其启动子顺式作用元件在冰糖橙和枸橼C-05中的种类和数量存在较大差异。冰糖橙和枸橼C-05叶片瞬时过表达结果显示，SWEET2a促进Xcc的繁殖，且拟南芥过表达转基因株系接种毒性菌Pst.DC3000(Pseudomonas syringae tomato DC3000)后，单位叶面积菌含量显著高于野生型。SWEET2a蛋白部分定位于质膜，表明SWEET2a... 相似文献
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采集湖南省6个柑橘产区的呈现典型溃疡病症状的柑橘叶片、枝条或果实样品26份，分离溃疡病菌株，采用柑橘溃疡病特异性引物鉴定、细菌保守的16S rDNA序列分析及重复序列PCR基因指纹分析(Rep–PCR)方法，分析具有地域代表性的12个菌株间基因组多态性。结果显示，12个菌株在BOX–PCR和ERIC–PCR中扩增出相同数量的多态性条带，无法通过Rep–PCR对菌株进行区分；串联重复位点多态性分析表明，CCB–2、CCB–3和CCB–10 这3个菌株在GT1位点上出现片段大小多态性；通过活体注射接种方式，将12个溃疡病菌株接种至冰糖橙叶片，结果CCB–2和CCB–4菌株表现出较稳定致病力，综合病情指数达到75%以上，表明CCB–2相比其他11个菌株可能在基因组序列水平存在多态性，且影响菌株的致病力水平。 相似文献