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【目的】确定类猪圆环病毒P1 存在开放阅读框ORF2 和ORF3;【方法】采用Trizol 法,提取类猪圆环病毒 P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA,纯化之后,分别用P1 ORF2 和 ORF3 特异性引物进行RT-PCR,应用AxyPrepTM DNA 凝胶回收试剂盒回收PCR 产物,转化Trans5α 感受态细胞,挑取单菌落,经PCR检测为阳性后测序。同时,利用rapid-amplification of cDNA ends (RACE) 技术分别扩增P1 病毒 ORF2 和 ORF3 的5′-与3′-末端。另外,根据P1 ORF2 和ORF3 的序列预测其B细胞抗原表位,采用标准的逐步固相合成法合成表位肽,与载体蛋白KLH偶联后,免疫新西兰大白兔制备抗 P1 ORF2 和ORF3 的多克隆抗体。采用常规间接ELISA法检测分离血清效价,包被抗原用合成肽,450 nm 波长下测定,血清抗体效价为S/N ≥2.1的血清最高稀释度。 然后,用P1 双拷贝分子克隆转染PK-15细胞,通过免疫组化方法对该多抗与P1 的反应性进行检测,同时利用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中P1 的拷贝数。【结果】利用ORF2和ORF3特异性引物对P1 RNA 进行的RT-PCR,均能扩增出目的片段,回收测序大小分别为111 bp和128 bp,分别与P1 ORF2 和ORF3 进行同源性比较,序列同源性均为100%;RACE技术分析,得到P1 ORF2 的5′-和3′-RACE 末端分别为第11位（G) 和第168位（T),P1 ORF3 的5′-和3′-RACE 末端分别为第285位（T) 和第 579位（A）。根据预测结果,合成肽的氨基酸序列分别为ORF2：CLSRLPQSERPPGRW和ORF3：CVYPKVRERRVLKMP;用ORF2 和ORF3 表位肽与载体蛋白KLH 的偶联物免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价均达到1﹕512 000以上,并且能够与P1 病毒发生特异性显色反应,应用蓝色DAB显色试剂盒染色结果为紫蓝色,多数在细胞浆,少数在细胞核,而对照组细胞无显色反应。定量PCR检测结果显示,P1可以在转染P1双拷贝分子克隆的PK-15细胞中复制,并且转染后104 h 增殖量达最大。【结论】通过转录分析和免疫组化试验分别从转录和蛋白质水平上证实了类猪圆环病毒P1 存在ORF2 和ORF3。 相似文献
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一、越夏番茄的病害防治越夏番茄的病害防治,一定要坚持“预防为主,综合防治”的方针,在病害未发生前,及早有针对性地进行防治。现就越夏栽培进口番茄品种“百利”可能发生的病害,按时间顺序排列。可按照病害发生时间,每隔15天,高质量的预防一次,达到事半功倍的效果。 相似文献
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通过近几年来对玉米从收获(田间)到入场院未脱粒前这一时间段的脂肪酸值测试,依据国家标准规定的玉米品质储存指标,根据测定的脂肪酸值的变化,说明玉米入场院后采取合理的储存方式,提高玉米新鲜度极为为重要,为科学、合理储存玉米提供依据. 相似文献
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40％毒死蜱水乳剂防治苹果绵蚜田间药效试验 总被引：1，自引：0，他引：1
苹果绵蚜(EriosomalanigerumHausmann)是我国的检疫性害虫之一,近年来在苹果种植区发生蔓延较快,已成为果树的重要防治对象。据有关资料报道,毒死蜱乳油防治苹果绵蚜效果很理想。但在苹果上喷洒乳油制剂时会使果实表面不光滑,影响商品价值。为此,我们于2005年用40%毒死蜱水乳剂对苹果绵蚜进行了田间药效试验,现将试验结果总结如下。1材料与方法1.1材料供试药剂为40%毒死蜱水乳剂(山东华阳科技股份有限公司)和48%乐斯本乳油(美国陶氏益农公司)。试验树为11年生的红富士品种。1.2方法试验设40%毒死蜱水乳剂1500倍(1)、2000倍(2)、2500倍(3),4… 相似文献
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草原不但是陆地生态系统的主体,有防风固沙、保持生态环境的作用,还是畜牧业发展的主要土地,但是鼠害严重一直以来都对草原产生着极大的影响,会造成草原退化严重,甚至是寸草不生,还易引起疾病的传播,给畜牧养殖带来严重的危害,因此防治鼠害是对于保持生态环境,发展畜牧业来说都是重中之重的工作。 相似文献
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为探索治理沙化草原的有效途径,引进和推广适宜沙化草原生长的优良牧草品种尤为重要。通过引进多种优良牧草品种对沙化草原进行播种试验观察,研究其生长特性、固沙效果、生态价 相似文献