一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究     

黄兵  马秀丽  宋敏训  王莉莉  李峰  陈溥言 《西南大学学报(自然科学版)》2005,27(6):881-884

根据新城疫病毒（NDV）融合蛋白和禽流感病毒（AIV）核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156bp和219bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H;亚型AIV的最低病毒量分别为10^3.7EID。和10^3.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT—PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV．感染的快速鉴别。  相似文献   

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备     

刘伟  郭抗抗  林鸷 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2015,43(2):7-13,22

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。  相似文献   

植物病毒载体介导的可溶性甲烷单加氧酶B亚单位在蚕豆植物中的表达   总被引：4，自引：0，他引：4  

王振东 《辽宁农业科学》2005,(4):5-8

用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位（Soluble Methane Monoxygermse-B component：SMMO-B）的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus；CIYVV）侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W基因组的NIb／CP基因之间，构建了重组病毒克隆pCV—mmoB。用上述重组病毒克隆接种该病毒的自然寄主植物蚕豆，表现了与野生型CIYVV相同的症状。RT—PCR检测结果表明，子代病毒基因组中的外源基因获得了转录。蛋白质杂交（Western blotting；WB）检测结果表明，sMMO—B亚单位蛋白在被重组病毒克隆侵染的寄主植物中获得了表达。  相似文献   

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达     

马江涛  卢曾军  曹轶梅  郭慧琛  郭建宏  祝秀梅  刘在新  杨孝朴 《甘肃农业大学学报》2007,42(4):5-10

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.  相似文献   

基于粗集理论的数据库知识发现的属性约简算法   总被引：2，自引：1，他引：2  

康立军  吴丽丽 《甘肃农业大学学报》2005,40(5):689-692

讨论了Rough集理论中属性约简问题,提出了数据库知识发现过程中用于属性约简的基于属性重要性的约简算法,基于差别矩阵的属性约简算法和基于遗传算法的属性约简算法,从而可以导出数据库中属性约简问题的相对最优解。  相似文献   

兔出血症病毒（RHDV）及其免疫复合物在兔体内的动态分布     

王林川  钟绍周 《江西农业大学学报》1990,12(1):73-77

用RHDV人工感染易感兔,每隔4小时剖杀一组,整个病程大多为24小时,且病变典型.血凝试验查得,主要脏器病毒出现时间顺序是肝(攻毒后12小时)、脾、心、肾(16小时)、肺(20小时);病程后期,病毒含量从高到低依次为肝、脾、肺、肾、心。免疫荧光间接法检查感染兔各脏器,发现病毒经肌注兔体后4小时,即可定位于肝细胞,并在肝细胞核内复制增殖;兔感染病毒后16小时,在肝、脾、肾小球中可检出有免疫复合物沉着或抗体附着。电镜检查,肝细胞核内发现有病毒粒子,直径为25～30nm,细胞结构破坏严重。作者认为,RHDV 是一种 DNA 病毒;免疫复合物引起的免疫损伤及肝细胞结构、功能被破坏是兔发生病毒性出血症的重要原因。  相似文献   

抗猪瘟病毒单克隆抗体的研究——Ⅱ抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立     

唐玉新  周作红  王亚鸣  沈秋姑  徐兰芳  王承浩 《江西农业大学学报》1990,(3)

用聚乙二醇沉淀浓缩纯化猪瘟兔化弱毒中国株(SFV-C)免疫 BALB/C 小鼠,取其脾脏,制备淋巴细胞,与 FO 骨髓瘤细胞融合,经 EliSA 检测和有限稀释法克隆化,最后筛选出5株对SFV 的单克隆抗体杂交瘤细胞.所制成的腹水抗体,一株只对 SFV-C 发生特异性反应,四株与SFV-S,SFV-F 及 BVDV oregon 发生微弱的交叉反应.细胞上清液的 EliSA 效价为1:800～1600,腹水效价为1:10~6～10~7.  相似文献   

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建及初步应用     

邱亚峰  葛菲菲  陈溥言 《中国农业科学》2006,39(11):2341-2346

【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS-BGS。将该载体用NheⅠ线性化后，用脂质体转染已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，X-gal染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有E.coli F因子以及两同向的loxP位点的MDV1转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDV1细菌人工染色体的构建奠定了基础。  相似文献   

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力     

贾立军  张艳梅  李军伟  韦栋平  刘红旗  陈素娟  彭大新  张如宽  刘秀梵 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2003,24(2):11-13

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d，重组鸡痘病毒免疫组仅有13％～20％鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后，重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100％的保护率，而未免疫组全部死亡。结果表明：重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答，但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击，保护效果达到或优于目前应用的灭活苗，显示出良好的应用前景。  相似文献   

百合病毒脱毒及检测技术研究进展   总被引：1，自引：0，他引：1  

王丽花  王继华  瞿素萍  杨秀梅  吴学尉 《广西农业科学》2007,38(6):673-677

阐述百合病毒的种类和危害,系统地介绍热处理、茎尖培养、珠芽培养、热处理结合茎尖培养、病毒抑制剂结合茎尖培养等5种脱毒方法,以及利用指示植物、电镜技术、酶联免疫和分子生物学技术检测百合主要病毒的方法。  相似文献