全文获取类型
收费全文 | 3128篇 |
免费 | 142篇 |
国内免费 | 363篇 |
专业分类
林业 | 19篇 |
农学 | 179篇 |
基础科学 | 2篇 |
145篇 | |
综合类 | 1319篇 |
农作物 | 114篇 |
水产渔业 | 139篇 |
畜牧兽医 | 1532篇 |
园艺 | 87篇 |
植物保护 | 97篇 |
出版年
2024年 | 44篇 |
2023年 | 137篇 |
2022年 | 136篇 |
2021年 | 137篇 |
2020年 | 133篇 |
2019年 | 162篇 |
2018年 | 88篇 |
2017年 | 151篇 |
2016年 | 198篇 |
2015年 | 205篇 |
2014年 | 193篇 |
2013年 | 204篇 |
2012年 | 315篇 |
2011年 | 291篇 |
2010年 | 263篇 |
2009年 | 256篇 |
2008年 | 240篇 |
2007年 | 160篇 |
2006年 | 118篇 |
2005年 | 64篇 |
2004年 | 51篇 |
2003年 | 37篇 |
2002年 | 12篇 |
2001年 | 4篇 |
2000年 | 12篇 |
1999年 | 9篇 |
1998年 | 2篇 |
1997年 | 5篇 |
1996年 | 1篇 |
1995年 | 1篇 |
1994年 | 2篇 |
1991年 | 2篇 |
排序方式: 共有3633条查询结果,搜索用时 31 毫秒
61.
为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。 相似文献
62.
为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。 相似文献
63.
为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化。以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21(DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的蛋白。重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期。确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80 000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min。用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1 280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性... 相似文献
64.
为了获得猪星状病毒(Porcine astrovirus, PAstV)重组蛋白nsP1a/4和多克隆抗体nsP1a/4,试验采用PCR技术扩增得到nsP1a/4基因片段,通过双酶切技术鉴定重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a。利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白nsP1a/4,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白nsP1a/4表达情况及可溶性。利用Ni-Agarose Resin纯化重组蛋白nsP1a/4,再通过Western-bolt验证。以纯化的重组蛋白nsP1a/4免疫健康新西兰大白兔制备多克隆抗体nsP1a/4,通过Western-bolt检验多克隆抗体nsP1a/4的特异性。结果表明:试验扩增出nsP1a/4基因片段,成功构建出重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a,重组蛋白nsP1a/4以包涵体形式在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中大量表达。经Ni-Agarose Resin纯化的重组蛋白nsP1a/4单一,Western-bolt成功鉴定到重组蛋白nsP1a/4,多克隆抗体nsP1a/4能与重组蛋白nsP1a/4发生特异性结合。说明试验成功制... 相似文献
65.
为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明:合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×106 IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。 相似文献
66.
67.
本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。 相似文献
68.
猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)属于呼肠孤病毒科,轮状病毒属,是引起幼年仔猪发生腹泻的主要病原之一,常与其他病原发生混合感染。PoRV结构蛋白VP4、VP6分别组成病毒的纤突及内衣壳,在病毒侵入、复制以及维持病毒粒子形态中起到重要作用。为研究PoRV VP4和VP6蛋白相关特性,分别扩增VP4开放阅读框中抗原性较好的两部分:58~1 080 bp基因片段(1 023 bp)、1 657~2 328 bp基因片段(672 bp),以及VP6完整开放阅读框(1 191 bp),成功构建重组表达质粒pET32a-VP4-672、pET32a-VP4-1023和pET32a-VP6,经测序正确后转化BL21感受态细胞中,经IPTG诱导,重组蛋白均以包涵体形式表达,融合蛋白大小分别约为44,58,64 kDa,与预期大小相符。将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体,间接ELISA方法测定多抗效价均在1∶106以上,免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)检测结果显示多抗均可与病毒蛋白产生良好的抗原抗体反应。本研究结... 相似文献
69.
本实验室前期构建了缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒株SY18△I226R,将其高、低单剂量(分别为107TCID50和104TCID50)接种家猪21 d后,对致死剂量ASFV SY18毒株的攻击,免疫猪均能达到100%保护,具有作为ASF疫苗候选株的潜力。为了能够有效区别家猪感染ASFV野毒株和SY18△I226R减毒株,本试验从ASFV SY18株基因组中扩增得到I226R基因片段,克隆到原核表达载体pET32a,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,纯化后获得I226R蛋白(pI226R)。以纯化的pI226R为包被抗原,以不同缺失毒免疫猪或自然毒感染康复猪血清为检测对象,建立了针对pI226R抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,pI226R重组质粒在BL21(DE3)细胞中经IPTG诱导表达,获得的蛋白大小为28 kDa。以pI226R为包被抗原的间接ELISA检测结果显示,该方法对阴性猪血清和SY18△I226R疫苗候选株接种猪血清检测的D45... 相似文献
70.
利用PCR技术扩增蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)E蛋白第三结构域(DomainⅢ,DⅢ)基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-TBEV-E-DⅢ。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,利用镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化目的蛋白。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立TBEV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组蛋白TBEV E-DⅢ在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,蛋白表达的最佳条件为30℃、0.6 mmol/L IPTG诱导6 h; TBEV抗体间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,该方法可特异性检测TBEV阳性血清,与寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)和西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数(CV)均小于10%。结果表明,成功表达并纯化了TBEV E-DⅢ重组... 相似文献