野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进及其鉴定     

林观平  李树梅  熊亮  周克元 《湛江医学院学报》2008,26(2):115-119

目的为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coliBJ5183(Ad-1 cells),以获得重组腺病毒质粒,经限制酶PacⅠ线性化后,转染293细胞,检测PTEN蛋白的表达,并以Ad-PTEN感染人乳腺癌MCF-7细胞后,测其感染率。结果获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(Ad-PTEN),受Ad-PTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因PTEN,荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。Ad-PTEN感染的人乳腺癌MCF-7细胞,感染率达80%~90%。结论PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建,方法较简便、快速,且生成的病毒滴度高、感染率高。  相似文献   

VEGFR1基因特异性siRNA的筛选     

李艳  张必良 《安徽农业科学》2008,36(18)

[目的]筛选血管内皮生长因子受体(VEGRF)基因特异性小干扰RNA(Small Interference RNA,siRNA),为肿瘤等疾病的基因治疗寻找一种新途径。[方法]以高表达VEGFR1的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为模型,采用RNA干扰技术,化学合成了3条针对血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的特异性siRNA,用Lipofectamine2000TM转染HUVEC细胞株,通过Real time RT-PCR技术检测HUVEC细胞VEGFR1基因mRNA的表达。并对效果最好的VEGFR1 siRNA-2进行siRNA的浓度梯度效果检测。[结果]结果表明,与对照组相比,所设计的3条siRNA均能不同程度地抑制VEGFR1 mRNA的表达,其中siRNA-2号最有效,浓度为50 nmol/L时抑制率达到95%左右。在浓度梯度试验中,VEGFR1 siRNA-2转染浓度为50 pmol/L时,对VEGFR1基因的沉默效果还能达到50%左右。[结论]所设计的siRNA能有效抑制VEGFR1基因的表达,为RNAi用于靶向VEGFR1的基因治疗提供了非常有效的siRNA序列。  相似文献   

RNAI在基因治疗中的应用及其设计     

何承伟  刘芳  刘新光  梁念慈 《湛江医学院学报》2006,24(1):66-68

与基因有关的疾病众多,有的甚至是直接的因果关系。以蛋白质为靶点干预组织细胞的功能是现代医药预防和治疗疾病的基础之一。然而以传统方法改变蛋白质功能的化学药物往往特异性不高,副作用多。根据碱基配对原则以mRNA为靶点理论能高度特异地阻断蛋白质的表达,从而达到从根本上治疗疾病的目的。在过去20 a左右的时间里,反义核酸及核酶技术在这方面扮演了重要角色,然而它们封闭蛋白质表达的效果仍难于达到治疗疾病的水平。由双链RNA诱导的基因沉默现象称为RNA干涉(RNA in terference,RNA i)。RNA i的诞生又一次点燃了人们的希望。由…  相似文献   

Cre-LoxP系统调控肠道粘蛋白2启动子活性和特异性     

翟亚峰  束刚  张志岐  朱晓彤  江青艳  李加琪  吴珍芳 《农业生物技术学报》2012,20(2):152-156

靶基因的高丰度组织特异性表达是基因治疗和制备转基因动物的重要条件。运用Cre-LoxP系统是提高组织特异性启动子转录活性的有效途径之一。本研究利用Cre-LoxP系统,以肠道粘蛋白2启动子调控Cre重组酶表达,转染细胞后检测荧光素酶活性。结果显示,Cre-LoxP系统能使粘蛋白2启动子介导的靶基因在肠细胞SW480中的表达量提高约6倍。细胞特异性检验后发现,Cre-LoxP系统显著弱化了肠道粘蛋白2启动子的细胞特异性。研究结果提示,运用Cre-LoxP系统尽管可以大幅提高弱启动子的活性,但对启动子的特异性要求较高。  相似文献   

昆虫杆状病毒的研究与应用     

王晓玲  魏美才  夏春兰 《河南农业科学》2006,(6):61-65

杆状病毒是鳞翅目昆虫的重要病原微生物,在重要农业害虫的生物防治中具有很大的应用前景。同时,杆状病毒—昆虫细胞表达系统是一类重要的真核表达系统,现已成为目前基因工程四大表达系统之一。另外,杆状病毒是非复制型载体,能高效表达目的蛋白,其作为基因转移载体在基因治疗中已显示出良好的应用前景。文中综述了杆状病毒在以上方面应用的最新进展。  相似文献   

病理性瘢痕的基因治疗进展     

何海填  梁杰  罗少军 《湛江医学院学报》2007,25(5):564-567

病理性瘢痕的形成机制尚不明确,目前的治疗也未取得良好效果,而基因治疗有望从根本上治疗病理性瘢痕。本文从抑制成纤维细胞增殖、调节细胞外胶原代谢、改善细胞外环境阐述病理性瘢痕基因治疗的新进展。  相似文献   

锌指核酸酶技术研究进展   总被引：1，自引：0，他引：1  

王晓静  武建明  王洪梅  李秋燕  何成强  刘晓  高运东  仲跻峰  何洪彬 《家畜生态学报》2011,32(1):1-4

重组锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白,可切割特异DNA序列,引起DNA双链断裂(double strand break,DSB),提高了依赖同源重组完成特定基因改造和修饰等的基因打靶的效率,为转基因及基因治疗研究提供了更有效的技术...  相似文献   

RNA干涉原理及其应用   总被引：5，自引：0，他引：5  

张祖新 《湖北农学院学报》2002,22(6):560-565

RNA干涉是指外源dsRNA引发生物体内的基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后的沉默现象，它与植物中的共抑制和真菌中的基因压制可能具有相同的作用机制。在这一过程中，需要eIF2c类似蛋白因子、RNA螺旋酶、RNA依赖性RNA多聚酶、核糖核酸酶、ATP和转膜蛋白参与。RNA干涉可以用于功能基因组学研究，也可用于克服转基因生物的基因沉默现象，使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达，还用于基因治疗，抑制有害基因的表达等。  相似文献   

奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定          下载免费PDF全文

张志鹏  江静宜  夏海磊  冀德君  李明勋  杨章平 《家畜生态学报》2019,40(5):24-28

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。  相似文献   

反义RNA及其抗病毒病的应用研究     

孟庆文  于康霞 《预防兽医学进展》2001,3(3):23-27

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