GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究   总被引：11，自引：0，他引：11  

朱道圩  米银法  陈延惠  王静毅  刘中杰 《河南农业大学学报》2003,37(2):145-148

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.  相似文献   

猪前脂肪细胞为核供体生产表达绿色荧光蛋白的转基因克隆胚胎   总被引：1，自引：0，他引：1  

潘登科  万荣  刘吉  牟玉莲  张莉  李奎  冯书堂 《畜牧兽医学报》2007,38(12):1389-1393

分离培养了成年猪前脂肪原代细胞，并对前脂肪细胞向成熟脂肪细胞进行诱导分化，油红O染色法鉴定了脂肪细胞。利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP—N1转染前脂肪细胞，经过G418筛选获得了阳性细胞株。然后分别以前脂肪细胞、转绿色荧光蛋白（GFP）前脂肪细胞及胎儿成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植，结果表明：前脂肪细胞（8．8％）和胎儿成纤维细胞（8．3％）的囊胚发育率无显差异著（P〉0．05）；与前脂肪细胞相比，转基因前脂肪细胞的囊胚发育率降低，但差异不显著（3．7％ vs．8．8％，P〉0．05）。前脂肪细胞为核供体生产转基因克隆胚胎，能够获得转基因囊胚。虽然囊胚发育率不高，但为生产脂肪细胞转基因克隆猪奠定了基础。  相似文献   

根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白（GFP）基因植株再生   总被引：2，自引：0，他引：2  

汪波  彭定祥  孙珍夏  张娜  邢秀龙 《作物学报》2007,33(10):1606-1610

以苎麻优良品系“5041-3”子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBIN m-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。  相似文献   

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建   总被引：2，自引：0，他引：2  

胡桂兵张上隆  徐昌杰林顺权 《华南农业大学学报》2005,26(4):118-120

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．  相似文献   

生防改良菌株F1-35的GFP标记及其对西瓜幼苗生理及防御系统的影响     

甘良  查顺清  刘继红  蓝星杰  王阳  宗兆锋 《西北农业学报》2015,24(12):108-116

为探究生防改良菌株F1-35的绿色荧光蛋白标记及其在标记后相关性状的改变情况,采用PEGCaCl2法介导原生质体转化,成功地将GFP基因转入到生防改良菌株F1-35中,转化率为每微克质粒DNA6个转化子,转化子经继代培养5代后仍能在含潮霉素B的培养基上正常生长,且其荧光稳定,强度良好;其分生孢子也能表达强烈的荧光。灌根处理西瓜幼苗发现,与原始生防改良菌株F1-35比较,经GFP标记后的菌株F1-35-GFP对西瓜的促生、抗逆作用以及其在西瓜幼苗根部的定殖情况和对西瓜枯萎病的防治效果未发生改变,防治效果仍能达60%以上;通过分析F1-35对西瓜枯萎病的防治效果及其对西瓜幼苗防御酶的影响关系发现,F1-35能提升PPO等防御酶的活性,从而抑制西瓜枯萎病的发生。可见,GFP能稳定存在于生防改良菌株F1-35中,且不对其促生、抗逆作用及防效产生影响,F1-35可通过提升西瓜幼苗防御酶活性来防治西瓜枯萎病的发生。  相似文献   

39K基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和转录的影响     

李俊  张婷  张媛媛  全滟平  舒特俊  聂作明  于威 《农业生物技术学报》2016,(3):416-425

39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白.迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV) 39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚.本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系BmN细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度.进一步利用qPCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P＜0.01).为了进一步了解39K基因对BmNPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用.综上所述,可知39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强.本研究结果将为深入了解BmNPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料.  相似文献   

利用GFP标记的Ralstonia solanacearum鉴定马铃薯青枯病抗性     

陈卓  肖熙鸥  陈曙  李可  邹华芬  金辉 《中国瓜菜》2021,(1):35-41

青枯病是危害马铃薯产业的重要病害,选育与推广抗青枯病品种是防控青枯病最高效的手段。目前已有的人工接种和田间抗性鉴定的方法不能有效区分处于潜伏侵染与完全抵抗侵染的材料,而利用GFP标记的Ralstonia solanacearum能够有效解决上述问题。笔者通过电击转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯菌P2中,成功获得了能够稳定遗传且不影响其致病力并带有绿色荧光报告的青枯菌菌株P2-Tac-EGFP。通过对感抗材料进行接种,结果表明,P2-Tac-EGFP能够有效区分感抗材料,并且P2-Tac-EGFP在感病材料的根部和茎部大量分布,而在抗病材料的根部仅有少量分布。综上所述,利用GFP标记的R.solanacearum能够快速准确地鉴定马铃薯青枯病抗性。  相似文献   

水稻种胚特异性启动子OsESP1的克隆及其表达特性分析     

房孝良  刘炜  安静  王庆国 《作物学报》2011,37(10):1904-1909

以水稻品种“中花11”基因组DNA为模板,通过PCR的方法,对水稻基因OsESG上游调控序列扩增,获得长度约为1.4 kb 的特异性条带,命名为OsESP1。以OsESP1与带有GUS报告基因的植物表达载体连接,经农杆菌介导转化获得转基因水稻阳性植株。结合组织化学染色法,检测GUS报告基因的表达特性,结果表明,由OsESP1所调控的GUS报告基因仅在水稻种胚中特异表达,而在其他组织中均未被检测到,初步证明OsESP1为水稻种胚特异性启动子。  相似文献   

以对潮霉素抗性为筛选标记的棉花遗传转化   总被引：8，自引：1，他引：8  

岳建雄  张慧军  张炼辉 《棉花学报》2002,14(4):195-199

以 HPT基因作为筛选标记基因 ,潮霉素作为筛选剂 ,通过农杆菌介导法将 GFP基因导入棉花细胞并得到再生植株。经过 Southern杂交证实外源基因已经整合到棉花基因中 ,荧光显微镜可以观察到绿色荧光 ,说明 GFP基因得到表达。研究确定了潮霉素作为棉花转化的筛选剂在农杆菌介导的转化中适用的浓度范围及筛选方法 ,即棉花转化中潮霉素的筛选浓度范围为 2 .5～ 1 0 mg· L- 1,在有 GFP等一些易于观察和检测的标记基因存在时 ,起始浓度可用较低 ( 2 .5 mg· L- 1)的筛选浓度 ;而在没有标记基因或检测方法较复杂时 ,起始浓度用较高 ( 1 0 mg· L- 1)的筛选浓度  相似文献   

徐淮山羊LPL基因克隆及其表达产物亚细胞定位的研究     

秦玉蓉  许峰  田智泉  高波  张振韬  阴彦辉  孙敏  李碧春 《畜牧兽医学报》2011,42(6)

旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位.本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-LPL.聚乙烯亚胺(PEI)介导pEGFP-C1-LPL转染NIH-3T3细胞,48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并用RT-PCR方法检测LPL mRNA在细胞内的表达.结果,成功克隆出山羊LPL基因1 530 bp长的cDNA,完整阅读框大小为1437 bp,共编码478个氨基酸,GenBank登录号为GU082383.信号肽区域预测结果表明LPL蛋白含有一小段信号肽序列,其可能性为100%.信号肽酶切割位置在第23和24个氨基酸之间,其可能性达到65.9%.成功构建融合表达载体pEGFP-C1-LPL,并且RT-PCR显示转染后LPL在mRNA水平上表达明显.EGFP-LPL融合蛋白定位在NIT-3T3细胞外和细胞膜部分.结果表明,首次成功克隆出徐淮山羊LPL基因cDNA;重组质粒pEGFP-C1-LPL构建成功,并在NIH-3T3细胞中明显表达.  相似文献