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1.
转基因研究已证明鸡是一个很好的试验材料.转基因鸡的研究,极有助于动物生物工程、生物反应器工程和实验模型的发展.虽然它的几个生理特性对有效地进行转基因带来了一定的障碍,但是转基因鸡遗传和生理特性上的各种优势是无可比拟的.目前已从胚胎中获取原始生殖细胞(PGCs)或从成熟公鸡中得到睾丸细胞,建立了胚胎介导转基因系统和睾丸介导转基因系统,这些方法比较有效且有微小的技术改进.本文回顾了以前用原始生殖细胞和睾丸细胞进行转基因鸡的研究,并总结了鸡模型在生物医学和生物工程学上的发展以及在这个领域的成果. 相似文献
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以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。 相似文献
3.
旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础. 相似文献
4.
旨在克隆徐淮山羊脂蛋白酯酶(LPL)基因的cDNA,并通过EGFP融合蛋白实现该基因亚细胞水平的表达定位.本研究通过RT-PCR方法克隆徐淮山羊LPL基因cDNA,并初步进行生物信息学分析,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-LPL.聚乙烯亚胺(PEI)介导pEGFP-C1-LPL转染NIH-3T3细胞,48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并用RT-PCR方法检测LPL mRNA在细胞内的表达.结果,成功克隆出山羊LPL基因1 530 bp长的cDNA,完整阅读框大小为1437 bp,共编码478个氨基酸,GenBank登录号为GU082383.信号肽区域预测结果表明LPL蛋白含有一小段信号肽序列,其可能性为100%.信号肽酶切割位置在第23和24个氨基酸之间,其可能性达到65.9%.成功构建融合表达载体pEGFP-C1-LPL,并且RT-PCR显示转染后LPL在mRNA水平上表达明显.EGFP-LPL融合蛋白定位在NIT-3T3细胞外和细胞膜部分.结果表明,首次成功克隆出徐淮山羊LPL基因cDNA;重组质粒pEGFP-C1-LPL构建成功,并在NIH-3T3细胞中明显表达. 相似文献
5.
为克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体(PPAR)基因的cDNA,探讨徐淮山羊PPAR基因的生物信息学功能.根据GenBank中发表的绵羊PPAR基因序列,设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法克隆徐淮山羊脂肪组织中PPAR基因cDNA,提交GenBank,并运用DNAStar软件及在线工具进行生物信息学分析.成功克隆出徐淮山羊PPAR基因的编码区全序列cDNA,大小为1 428 bp,GenBank登录号为GU082382,有起始密码子ATG和终止密码子TAG,编码475个氨基酸;徐淮山羊PPAR基因序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊相应编码区(CDs)的同源性分别为81%、89%、92%、98%、99%,徐淮山羊PPAR氨基酸序列与鸡、鼠、猪、牛、绵羊的PPAR氨基酸序列同源性分别为92.9%、97.3%、98.3%、99.6%、99.8%;PPAR蛋白无信号肽区域,属于非分泌型蛋白. 相似文献
6.
为探索鸡Mx基因在细胞中表达的位置,以及Mx-EGFP融合表达时的抗病活性。构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-Mx,转染NIH-3T3细胞,通过报告基因EGFP的表达来定位Mx基因在细胞中表达的位置;通过抗VSV病毒试验来研究Mx-EGFP融合蛋白的抗病毒活性。结果显示,融合蛋白大部分在细胞质中表达,而细胞核中也有一部分表达;转染有质粒pcDNA3.0/EGFP-Mx的NIH-3T3细胞感染VSV病毒48h内,细胞没有发生病变;而只转染pcDNA3.0空载体的阴性对照组中,NIH-3T3细胞48h内已经发生病变。研究结果表明,Mx-EGFP融合蛋白主要分布在细胞质中,具有抗VSV病毒活性,能够延缓病毒感染病变时间。 相似文献
7.
为了获得大量的、可供试验研究和制作生物反应器的人瘦素蛋白,从人脂肪组织中提取总RNA,用RT-PCR法获得了编码人瘦素(leptin)167个氨基酸残基的cDNA序列,并克隆至载体pMD19-TSimple上进行序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板,用特异引物扩增瘦素基因,经EcoRI和BamHI双酶切,定向插入高效原核细胞表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE检测。结果:用RT-PCR法扩增得到的cDNA片断序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank公布的人瘦素基因序列一致;SDS-PAGE分析基因表达产物,在20 ku处有一特异条带,说明重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中可表达人瘦素蛋白。 相似文献
9.
鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、5．5×10^-5mmol／L β-巯基乙醇、10μL／mL非必需氨基酸、以及含1000U／mL LIF、10ng／mL bFGF和5ng／mL SCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第X期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2％和1．0％。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。 相似文献
10.
采用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒pBABE—hygro hTERT，获取端粒酶催化亚基（hTERT）。将其定向克隆至载体pEGFP-N1，构建重组的荧光真核表达载体pEGFP-N1-hTERT。经双酶切、测序及转染成纤维细胞鉴定均证实hTERT、基因忆拷入pEGFP—N1载体中，成功构建了荧光真核表达载体pEGFP—N1—hTERT。构建的pEGFP-N1-hTERT，为进一步筛选目的细胞和建立永生化细胞系奠定了基础. 相似文献