猪链球菌2型胞外因子的融合表达及多克隆抗血清的制备     

葛长城  王海丽  徐公义 《湖北农业科学》2009,48(10)

根据GenBank SS2(Streptococcus suis serotype 2,SS2)epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,同时亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX4T-2上,将构建的原核表达质粒pGEx4T-2-epf导入大肠杆菌(Eacterium coli)TG1中,诱导融合蛋白EF-GST的表达.经亲和层析、凝血酶切割后,获得纯化的EF为抗原蛋白,用其免疫家兔制备抗血清,成功制备了EF蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究EF的功能提供了有用的工具.  相似文献   

脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体对脂肪细胞增殖与凋亡的影响   总被引：3，自引：2，他引：1  

姜锦鹏  赵茹茜  陈杰  许雪萍  池豪 《中国农业大学学报》2009,14(1)

以0.1、1.0和10.0 μg/mL 3种剂量脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理体外培养的3T3-L1前脂肪细胞或经其诱导分化的脂肪细胞,采用四唑盐(MTT)比色法检测3T3-L1前脂肪细胞增殖能力,以乳酸脱氢酶漏出率为指标观察脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体对脂肪细胞的细胞毒性,用流式细胞仪、Hoechst 33258荧光染色分析脂肪细胞凋亡情况以及油红0染色法测定脂肪细胞脂肪含量.结果表明:用不同质量浓度(0.1、1.0和10.0μg/mL)的脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体处理可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,并影响脂肪细胞的脂肪合成(P<0.05),但对脂肪细胞无明显的细胞毒作用;还可见凋亡峰和典型的凋亡形态学改变,流式细胞仪检测出的脂肪细胞凋亡率分别为1.62%、2.33%和4.57%,呈浓度依赖性,与对照组(0.36%)比较,差异皆显著(P<0.01).提示:脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体可抑制前脂肪细胞增殖,诱导脂肪细胞凋亡并影响脂肪合成.  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒HH06株囊膜蛋白多克隆抗体制备及生物学功能检测     

白妍  赵蕾  杜威威  潘龙  黄小丹  杨贵君  李广兴 《中国畜牧兽医》2016,43(8):1967-1974

采用RT-PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus, IBV）HH06株E基因全长,经抗原性和亲水性分析,将E基因部分序列（193～327 bp）亚克隆于pET-32a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-32a-E1转化E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达获得大小约为23 ku的重组截短E1蛋白,Western blotting检测重组蛋白与IBV全病毒多克隆抗体能特异性反应。以纯化后的E1蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价达到2²⁰;Western blotting分析表明,E1多克隆抗体与重组表达蛋白具有良好的反应性;间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到PVAX-E1转染Hela细胞表达的E1蛋白和感染鸡胚肾细胞（CEK）中的HH06株IBV,抗E蛋白多克隆抗体的制备为E蛋白功能的深入研究奠定了基础。  相似文献   

PRRSV野毒感染猪群免疫接种弱毒活疫苗的效果分析     

许心婷  施开创  李常挺  龙飞翔  莫胜兰  陈汉忠 《中国畜牧兽医》2016,43(9):2447-2454

为评估猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）弱毒活疫苗的免疫效果,本研究在两个小型猪场各选取两窝仔猪,在免疫接种猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）弱毒活疫苗后不同时间采集血清,应用RT-PCR检测PRRSV核酸,应用N-ELISA和G-ELISA两种试剂盒检测PRRSV抗体。结果发现,免疫前0 d可以从仔猪血清中检测到PRRSV野毒株核酸,可持续到免疫后30 d;相对应的母猪在免疫前0 d可从血清中检测到PRRSV野毒株核酸。试验仔猪在免疫前0 d未能检测到PRRSV抗体,但在免疫后30～150 d均可检测到PRRSV抗体,其中N-ELISA试剂盒的阳性检出率在免疫后30、60 d高于G-ELISA试剂盒的阳性检出率,而在免疫后120、150 d则低于G-ELISA试剂盒的阳性检出率。使用两种ELISA试剂盒共同检测216份血清样品,检测结果的总体符合率为95.83%;配对χ²检验,P>0.05,两者差异不显著;Kappa值为0.87,属于极强一致性;两者相关系数r为0.605,具有显著线性相关。表明免疫接种弱毒活疫苗可以有效清除野毒感染猪群中的野毒株,N-ELISA和G-ELISA两种ELISA试剂盒均可用于评估弱毒活疫苗的免疫效果。  相似文献   

高致病性猪蓝耳病疫苗对猪瘟和蓝耳病抗体水平的影响     

李彩虹  何文  何子双 《安徽农业科学》2016,(8):110-112

[目的]研究高致病性猪蓝耳病(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)疫苗对猪瘟(Classical swine fever,CSF)和猪蓝耳病(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)抗体水平的影响。[方法]采用ELISA方法检测3个猪场248份血清的猪瘟(CSF)和猪蓝耳病(PRRS)抗体,并对CSF抗体阻断率和PRRS抗体的S/P值进行多重比较。[结果]猪场A(没有免疫HP-PRRS疫苗)、猪场B和猪场C(都免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗)全群猪的CSF抗体阳性率分别为94.29%、53.93%和66.29%,其PRRS抗体阳性率分别为42.86%、91.01%和82.02%。猪场A、C母猪和全群猪的CSF抗体阻断率极显著高于猪场B(P0.01);猪场A的育肥猪和全群猪的CSF抗体阻断率显著高于猪场C。猪场B的母猪、后备母猪、育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值极显著高于猪场A、C(P0.01),猪场C的育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值显著高于猪场A(P0.05)。[结论]免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗可能引起猪群CSF抗体水平降低,PRRS抗体水平提高。  相似文献   

乳铁蛋白酶标抗体的制备及其酶联免疫检测方法的建立     

李亚璞 《湖南农业科学》2016,(12):12-14

采用过碘酸钠法对抗牛乳铁蛋白抗体进行了辣根过氧化物酶标记,建立了二步式的双抗体夹心ELISA法,并对市售奶粉样品进行了测定。结果表明:所制备的酶标记抗体效价达到了1.6×106,与乳中主要其他蛋白如酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白基本没有交叉反应,特异性较好;将HRP-2B12稀释105倍,以1%OVA为封闭液、含3%BSA的PBST溶液为酶标抗体稀释液,在此条件下建立的ELISA方法实现了对奶粉样品的定性测定。  相似文献   

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选     

王锐  葛猛  陈一苇  方超  柴强强  李润成  余兴龙 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2016,42(6):647-653

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。  相似文献   

间接酶联免疫吸附法测定大鲵凝集素     

王晓龙  佟长青  李伟 《安徽农业科学》2016,44(33)

[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1∶16 000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1∶3 000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1∶30 000,抗原浓度在31.25~1 000.00 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数R~20.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。  相似文献   

家蚕GATA转录因子BmGATA6的克隆、多克隆抗体制备及组织细胞定位     

谭鹏  徐曼  梁航华  张亚军  胡仁建  崔红娟 《中国农业科学》2016,49(2):371-380

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）GATA转录因子BmGATA6,将其在原核细胞中进行表达,纯化重组蛋白,多次免疫小鼠获得BmGATA6多克隆抗体,为进一步分析BmGATA6在家蚕变态发育中的功能提供抗体条件。【方法】解剖家蚕获得5龄第3天的各组织及4眠至熟蚕整个时期的中肠组织,在液氮中研磨为粉末,利用Trizol法提取RNA,体外反转录得到cDNA。基于家蚕BmGATA6的基因编码序列设计全长特异引物,并以BmActin3作为内参,进行家蚕5龄第3天各组织及4龄眠期至熟蚕期各时期的RT-PCR检测。设计原核表达引物,扩增原核表达片段连接到pET32a载体上,构建原核表达载体,转化至BL21(DE3) Escherichia coil表达菌株。加入IPTG至终浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1。在16℃条件下培养20 h和37℃条件下培养5 h分别进行BmGATA6蛋白诱导表达。选取最佳诱导条件进行BmGATA6蛋白的大量诱导,用镍柱亲和层析法纯化家蚕BmGATA6蛋白,经多次免疫昆明小鼠后,最终获得BmGATA6多克隆抗体。利用ELISA法测定鼠抗BmGATA6蛋白多克隆抗体的效价,通过Western blot检测BmGATA6抗体的特异性。以家蚕5龄第6天中肠的石蜡切片作为样本,通过免疫荧光对家蚕中肠组织中的BmGATA6蛋白进行亚细胞定位。【结果】家蚕GATA转录因子BmGATA6的cDNA全长4 011 bp,ORF长为1 974 bp,编码657个氨基酸,包括205 bp的5′非翻译区序列（5′UTR）和1 832 bp的3′非翻译区序列（3′UTR）。该基因位于15号染色体上,基因全长12 326 bp,为多外显子基因,共含有8个外显子和7个内含子,具有2个典型的GATA锌指结构域,分别位于第470-521和531-582氨基酸区域。RT-PCR结果显示BmGATA6在5龄第3天家蚕中肠中显著高量表达,其次在马氏管中有少量表达,而在其他组织中没有检测到BmGATA6的表达。同时RT-PCR结果显示BmGATA6在4龄眠期到熟蚕期的中肠组织中持续高表达。构建BmGATA6 原核表达载体,通过不同温度与IPTG浓度诱导发现,BmGATA6重组蛋白在16℃诱导主要存在于上清中,在37℃诱导主要存在于包涵体中。在0.6 mmol·L^-1的IPTG、16℃下诱导20 h为最佳条件,利用镍柱亲和层析法获得较纯的BmGATA6重组蛋白,并利用纯蛋白多次免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用ELISA法对抗体效价进行了检测,显示BmGATA6抗体效价均高达1﹕128 000。Western blot结果显示BmGATA6抗体能特异地识别家蚕BmGATA6蛋白,其大小约为75 kD,与预测大小相符。免疫荧光结果显示BmGATA6蛋白在家蚕中肠的各类细胞中均有较高表达,且定位于中肠细胞的细胞核中。【结论】成功制备了BmGATA6多克隆抗体,分析了其在中肠组织中的亚细胞定位情况,推测BmGATA6在家蚕中肠的生理变化过程中扮演着重要调控角色,为进一步探索BmGATA6在家蚕中的功能奠定了基础。  相似文献   

抗犊牛肺炎支原体免疫初乳乳清的制备     

王超丽  剡根强  王静梅  高家登  杨龙龙  杨铭伟 《中国畜牧兽医》2014,41(8):85-90

为探讨抗犊牛肺炎支原体免疫初乳乳清的制备方法,本试验采用牛支原体灭活佐剂疫苗于经产前2～4周给怀孕母牛免疫接种2次,制备高免初乳,收集产后12 h之内的初乳,分别采用离心沉淀与过滤法制备脱脂初乳,采用不同的酸化法、酶化法、酸和酶结合法制备乳清,通过紫外分光光度计及ELISA方法检测乳清中的总蛋白含量及抗牛支原体抗体滴度。结果显示,4 ℃、3500 r/min离心30 min对初乳的脱脂效果最好,初乳总蛋白含量及抗牛支原体抗体滴度损失最少;酶和酸结合法的乳清析出率最高,维生素C（0.2 g/mL）处理法对脱脂初乳中蛋白损失最小,盐酸处理法对脱脂初乳中抗牛支原体抗体滴度损失最小。结果表明用0.6 mol/L盐酸调pH至4.6,室温下放置30 min,10000 r/min离心20 min是高免初乳乳清制备的适宜方法。  相似文献