牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达     

房红莹  陈钜豪  张欣  胡寻  罗满林 《华南农业大学学报》2009,30(1)

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.  相似文献   

牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验     

倪建宏  刘长彬  张宾  Graham W Kay 《新疆农业科学》2011,48(5):937-941

[目的]新鲜精液在离开生殖腺后存活时间很短.相关研究表明副睾液为精子的存活提供了特殊的环境.试验探讨和研究牛附睾精子在体外模拟附睾液中的存活试验的各因素的影响.[方法]试验对公牛附睾头部和尾部的摩尔渗透压和蛋白质浓度进行了分析,牛附睾尾部精子在不同蛋白浓度的CEP-2溶液中,在4℃条件下孵育120h.每24h做一次精子活力检测.[结果]5 d后精子活力仍然超过60;.附睾头、尾部的渗透压分别为(287.0±13.7)mOsm和(310.8±17.0)mOsm.蛋白浓度分别为(37.43±12.55)mg/mL和(50.58±11.08)mg/mL.[结论]附睾尾精子在蛋白浓度为40mg/mL,渗透压为345 mOsm时,精子存活率最高.  相似文献   

山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定     

宋玲玲  杨宏军  冯敏燕  侯佩莉  王洪梅  何洪彬 《山东农业科学》2013,45(2):28-30

从山东某地区发生呼吸道症状的奶牛场中采集样品,按常规方法处理后,接种牛肾细胞(MD-BK),分离病毒,盲传3代后,接种病料的MDBK细胞出现细胞圆缩、聚集成葡萄串样群落、在单层细胞上形成空洞等病变,且随着传代次数的增加,细胞病变更加规律。对所分离病毒进行TCID50测定,其TCID50值为108/ml;用IBRV特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,序列测定分析结果确认所分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒。  相似文献   

牛IgG轻链的分离纯化及其多克隆抗血清的制备     

李勐  李忠秋  李昭春  王君伟 《东北农业大学学报》2006,37(6):788-790

实验应用凝胶过滤和盐析等方法直接从牛初乳中分离纯化IgG,并应用化学方法断裂回收IgG轻链。分离纯化获得分子量约27.66 ku的IgG轻链蛋白溶液,蛋白质含量为0.105 mg.L-1,浓缩后免疫家兔,获得抗轻链抗血清,效价>11∶6,免疫双扩散和免疫电泳均为特异性条带,表明得到了纯化的IgG轻链及其特异性抗血清。  相似文献   

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立     

吕安  张志聪  宫平  张彤  刘艺林  李德琰  姜晓茜  刘蓓桦  刘凤华 《北京农学院学报》2016,31(4):61-66

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.  相似文献   

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响     

徐丹丹  王建发  张旭  刘东宇  许小楠  王乐  陈嘉  单旭菲  王晓雅  武瑞  杨彬 《中国农业科学》2017,50(3):574-581

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL~(-1)的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】(1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好。(2)空白对照组、1、5及10μg·mL~(-1) MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL~(-1) MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL~(-1)MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化。(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P0.05)。【结论】成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL~(-1)以下。这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响。即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状。  相似文献   

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响     

丁向彬  王轶敏  葛秀国  刘新峰  李吉霞  郭宏 《天津农学院学报》2012,19(2):19-23

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。  相似文献   

甘胆口服液对BRD犊牛血清急性期蛋白和氧化应激指标的影响     

陈久兵  马莉  陈娅婷 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2022,50(3):24-29

【目的】探讨甘胆口服液按推荐剂量用药对牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease,BRD）的治疗效果及对血清急性期蛋白（acute phase protein,APP）浓度和氧化应激指标的影响,为其在牛临床上的推广应用提供依据。【方法】选择40头自然发病的BRD犊牛,随机分成2组,分别为受试药物组（甘胆口服液0.2 mL/kg）、对照药物组（麻杏石甘散0.75 g/kg）,并增加健康犊牛12头作为空白对照组,按推荐剂量1次/d,连用7 d,分别于试验第0,3,5,7天记录犊牛的一般临床症状,并依据BRD评分表进行打分;在试验第0,7天随机抽取各试验组犊牛12头颈静脉采血,测定血清APP（结合珠蛋白（HP）、淀粉样蛋白A（SAA）、C-反应蛋白（CRP））浓度和氧化应激指标（丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC））水平。【结果】药物组试验犊牛第0天证候积分均≥5分,符合试验要求。用药第3,5,7天临床症状积分均不同程度降低（P<0.05）。在第5天时积分均<5分,第7天积分减少到最小值。麻杏石甘散组犊牛在第3天时的BRD治愈率高于甘胆口服液组（P>0.05）,但随着治疗时间的延长,甘胆口服液治愈率与麻杏石甘散相近,用药5 d后,两药物组治愈率均达到60%以上。BRD组犊牛第0天血清HP、SAA、MDA水平显著高于健康对照组（P<0.05）,GSH、T-AOC水平及SOD、CAT活性均不同程度低于健康对照组,但差异不显著（P>0.05）。经过药物治疗后,BRD组犊牛第7天血清HP、SAA、MDA水平显著下降,GSH水平和SOD活性显著上升（P<0.05）。【结论】甘胆口服液能明显改善BRD犊牛临床症状,有效缓解患BRD犊牛氧化应激状态,降低血清急性期蛋白水平。联合应用急性期蛋白和氧化应激指标可以对BRD犊牛进行早期诊断及疗效监测。  相似文献   

牛体外受精卵的二步法培养体系的研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

曹海清  陶勇  姚桂东  章孝荣 《动物医学进展》2007,28(6):31-35

以CR1aa为基础培养液,采用二步法对牛体外受精卵进行体外培养,完善牛体外受精卵的培养体系.实验一:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa 3 mg/mLBSA培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的囊胚率显著高于对照组,但卵裂率和囊胚孵化率无显著差异.实验二:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的卵裂率显著高于对照组,但囊胚率和囊胚孵化率差异不显著.实验三:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1mmol/L GSH培养,处理组前3 d为CR1aa 0.1 mmol/L GSH培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1 mmol/L GSH.处理组的卵裂率显著高于对照组,囊胚率极显著高于对照组,但囊胚孵化率差异不显著.结果表明,GSH与二步法培养系统结合相对于传统的一步法培养系统更适于牛体外受精卵的体外培养.  相似文献   

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察     

王秀美  考桂兰  高爱武  侯先志  高民 《畜牧与饲料科学》2011,(9)

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。  相似文献