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为建立快速、灵敏且可定量检测氟苯尼考耐药基因floR的环介导等温扩增方法(LAMP),根据GenBank登录的革兰阴性菌floR基因保守序列,利用PrimerExploerV4设计特异性LAMP引物,成功建立了快速检测氟苯尼考耐药floR基因的LAMP方法。该LAMP检测方法反应温度为63℃,反应时间为60min,具有可实时监测反应、定量检测出floR基因的拷贝数,以及操作简便的特点,灵敏度高,检测限为6.24×100拷贝,是普通PCR的100倍。用建立的方法检测对氟苯尼考不同敏感性的大肠埃希菌floR基因,结果显示,对氟苯尼考敏感、中介和耐药的菌株均检测到floR基因,其拷贝数与菌株MIC相关,提示floR基因不仅存在于氟苯尼考耐药菌中。所建立的floR基因LAMP检测方法可为floR基因的监测,以及氟苯尼考耐药性产生和传播机制的研究提供新的技术手段。 相似文献
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为了解牛支原体广西分离株的P81基因和vspY1基因的变异特点,为牛支原体病的诊断和防控提供依据,本研究对7株牛支原体广西分离株P81和vspY1基因进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析。序列分析结果显示,7株牛支原体的P81基因全长为2 100bp,编码700个氨基酸残基;vspY1全长为948bp^1 029bp,编码316~343个氨基酸残基。核苷酸相似性结果显示,7株分离株与参考株之间的P81基因相似性为94.7%~99.9%,而vspY1基因的相似性为78.4%~100%。核苷酸进化树结果表明,7株牛支原体P81基因和vspY1基因均与标准株PG45分属于不同的分支。抗原表位预测结果显示,7株分离株P81含有26~28个潜在的抗原表位,vspY1基因含有6~7个潜在的抗原表位。试验结果表明P81较保守,变异小,而vspY1基因变异较大,且P81和vspY1蛋白均存在抗原表位。 相似文献
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为初步研究猪源大肠杆菌O157:H7 (E.coli O157:H7)对氟苯尼考耐药性的产生和消除机制,本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将两株猪源大肠杆菌O157:H7诱导成氟苯尼考高度耐药菌株,采用无氟苯尼考压力下连续传代培养的方法将获得的氟苯尼考耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,检测耐药诱导菌和耐药消除菌对抗菌药物的敏感性,并检测菌株质粒携带的耐药基因。结果显示,经氟苯尼考耐药诱导,猪源大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定和头孢噻吩由敏感变为耐药,对头孢噻肟的敏感性由敏感变为中介,对氧氟沙星、环丙沙星和阿奇霉素由中介变为耐药;而经耐药消除后,菌株恢复对上述药物的敏感性;在菌株的质粒中检测到氟苯尼考耐药基因、喹诺酮类耐药基因和β-内酰胺酶基因,与耐药表型相符。结果表明,在氟苯尼考压力的长期存在下,猪源大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考产生耐药,且对青霉素类、头孢类和喹诺酮类药物产生交叉耐药,在去除氟苯尼考压力下连续培养,可消除菌株的部分耐药性。 相似文献
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副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。 相似文献
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[目的]明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据.[方法]采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位.[结果]在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3.PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017.PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性.[结论]广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行. 相似文献
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提取巨型艾美球虫(Eimeria maxima)南通株(NT株)配子体总RNA,应用RT-PCR技术对gam82基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析.结果表明,克隆的基因全长为1 791个核苷酸,具有一个完整的开放阅读框,编码596个氨基酸,与GenBank中发表的Houghton株gam82基因同源性为100%.根据对推导的氨基酸序列的二级结构和抗原表位分析的结果,筛选免疫原性良好的区域,命名为gam82-Y,进行原核表达.重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,gam82-Y基因片段在大肠杆菌中得到了融合表达,相对分子质量约为53 000.可溶性分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在.以 E.maxima高免血清为一抗进行Western-blot检测,显示重组抗原gam82-Y具有免疫原性. 相似文献
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2018年9月广西某羊场部分山羊发生流涕、咳嗽、呼吸困难和体温升高等临床症状的疾病,为确诊发病原因并提供治疗方案,采用病原分离培养、PCR扩增鉴定的方法进行诊断,并对分离菌进行生化鉴定、致病性试验和药敏试验。结果显示,病料在血平板有圆形的小菌落生长,革兰阴性小球短杆菌,而在PPLO培养基上不生长;病料的PCR扩增结果显示绵羊肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌均为阳性;所分离到的病原菌经生化鉴定,该菌符合多杀性巴氏杆菌的特性;用多杀性巴氏杆菌种属和D型多杀性巴氏杆菌特异性引物扩增为阳性;致病性试验显示该菌对小鼠有很强的致病性;药敏试验显示该菌对头孢他啶、头孢噻肟、氧氟沙星高度敏感,对复方新诺明、强力霉素、红霉素、青霉素为耐药。结果表明该病是由绵羊肺炎支原体和D型多杀性巴氏杆菌混合感染引起。 相似文献
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为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础. 相似文献
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为评价gain56基因重组表达产物作为亚单位疫苗预防鸡巨型艾美球虫(E.maxima),感染的效果,以E.maxima NT株配子体总RNA为模板,RT.PCR扩增和克隆gain56基因,选择该基因两段丰富抗原表位的编码区片段.利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌中进行截短表达.以可溶性的GST-gain56-2融合蛋白为免疫原,设立高、中、低(1.0 mg、0.5 mg、0.25 mg)3个剂量,单独或使用弗氏完全佐剂,于5 d、12 d和19 d对雏鸡进行3次免疫,26 d用5 ×10~4个E.maxima孢子化卵囊进行攻虫,8 d后迫杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析.结果显示:就相对增重率而言各免疫组比未免疫攻毒组的高27.6%以上,而各免疫组之间差异不显著(p>0.05);就卵囊减少率指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度减少,但是均小于75%;就ACI指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度增加,以中剂量蛋白佐剂组为最高.GST-gam56-2融合蛋白对于E.maxima感染具有一定的免疫保护效力. 相似文献