高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化     

李燕华  韦祖樟  谭菲菲  袁世山 《中国兽医寄生虫病》2010,18(3):13-20

反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上,做了以下三方面的工作：（1）将T7启动子换成hCMV（人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus）启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;（2）研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;（3）在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。  相似文献   

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用     

刘长龙  李燕华  袁世山 《安徽农业科学》2010,38(23):12891-12894,12897

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。  相似文献   

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析   总被引：3，自引：0，他引：3  

张建武  庄金山  刘长龙  王小敏  袁世山 《中国农业科学》2009,42(8):2949-2957

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。  相似文献   

中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究   总被引：12，自引：1，他引：11  

张建武  庄金山  袁世山 《中国农业科学》2008,41(6):1822-1831

 【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测,确定引起本次流行的致病病原及PRRSV的分子流行病学特征。【方法】利用（RT-）PCR对采集的样品进行PRRSV北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）以及瘟病毒的检测,对PRRSV阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV北美型阳性样品,PCV2阳性样品2份,其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV株可分为2个群。【结论】（1）PRRSV与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系;（2）2006年PRRSV流行株主要是以JX0612株为代表,但不同遗传特征的PRRSV也在流行。  相似文献   

单股正链RNA病毒3′非编码区的结构与功能研究进展     

刘萍  刘长龙  陆嘉琦  高飞  尹杨  姚火春  袁世山 《畜牧与兽医》2011,43(10)

单股正链RNA病毒基因组中的3′非编码区(3′UTR)可以形成二级或者高级结构,这些结构对维持病毒RNA的稳定性以及病毒的复制调控具有至关重要的作用.它不仅可以单独发挥作用,也可以与RNA或者蛋白相互作用调控病毒的复制、转录、翻译和包装等各个过程.本文对RNA结构和功能研究的一般方法,以及一些单股正链RNA病毒代表种属的3′UTR的结构和功能进行了综述,并且就研究前景和一些存在的问题进行了探讨.  相似文献   

单股正链RNA病毒3'非编码区的结构与功能研究进展     

刘萍  刘长龙  陆嘉琦  高飞  尹杨  姚火春  袁世山 《畜牧与兽医》2011,(10)

单股正链RNA病毒基因组中的3'非编码区(3'UTR)可以形成二级或者高级结构,这些结构对维持病毒RNA的稳定性以及病毒的复制调控具有至关重要的作用。它不仅可以单独发挥作用,也可以与RNA或者蛋白相互作用调控病毒的复制、转录、翻译和包装等各个过程。本文对RNA结构和功能研究的一般方法,以及一些单股正链RNA病毒代表种属的3'UTR的结构和功能进行了综述,并且就研究前景和一些存在的问题进行了探讨。  相似文献   

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立     

邓宇  张荣  丛雁方  张建武  袁世山  文心田  郑浩 《畜牧兽医学报》2011,42(7)

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因表达调控序列的初步解析     

高飞  孙志  郑海红  袁海峰  刘长龙  陆嘉琦  刘萍  尹扬  袁世山  童光志 《中国兽医寄生虫病》2011,19(6):65-70

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是世界养猪业的一个巨大的威胁。近年来,此病给各国养猪业造成了巨大的经济损失。本文立足于反向遗传操作技术,介绍了调控PRRS病毒粒子的感染性、基因组RNA复制、亚基因组mRNA转录以及翻译等重要过程的顺式调控元件的一级序列和高级结构的最新研究进展。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘长龙  张建武  韦祖樟  袁世山 《中国预防兽医学报》2010,32(11)

为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),本研究针对PRRSV的N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并优化了检测PRRSV的TaqMan荧光定量PCR方法。应用该方法检测其它主要猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的检测灵敏度可以达到10拷贝,比常规PCR灵敏10倍～100倍;结果表明,本实验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量,免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第7 d血清中病毒的载量差异不显著,而在第14 d差异显著,免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。  相似文献   

携带PCV-2 ORF2的感染性PRRSV克隆在Marc-145细胞表达的研究     

郑海红  张可煜  周艳  袁世山 《动物医学进展》2012,33(12):1-6

为解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)删除外源基因的机制,以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,构建在PRRSV全长基因组上同时包含其Nsp2区域缺失108nt及其ORF1与ORF2间插入猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2的全长cDNA pDCPV,将pDCPV转染Marc-145细胞,获得拯救病毒vDCPV。鉴定vDCPV的遗传稳定性发现,vDCPV比先前发表的只在PRRSV ORF1与ORF2间插入PCV-2ORF2获得的拯救病毒vCPV更具有遗传稳定性,这提示PRRSV删除外源序列的最主要机制是插入外源序列后导致基因组过长,由此可能影响N蛋白与基因组作用及其他结构蛋白包装过程。IFA结果显示,vDCPVP能微弱表达PCV-2cap蛋白。  相似文献