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CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。 相似文献
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