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大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料. 相似文献
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猪肌内前体脂肪细胞的体外培养 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究建立了猪肌内前体脂肪细胞的体外培养模型,以期为更深入研究猪肌内脂肪代谢提供新的实验方法。实验采集出生5d仔猪的背最长肌组织,Ⅱ型胶原酶消化2h后400目筛网过滤,然后1500r/min离心,沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)重悬后差速贴壁2h,弃去原有培养基,加入新的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)进行培养。细胞经传代且完全融合48h后,在完全培养基中添加0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),1μmol/L地塞米松(DEX),10mg/L胰岛素(INS)进行诱导培养48h,再换以含10mg/L胰岛素的完全培养基培养48h,最后换完全培养基继续培养,直至90%的细胞出现脂滴。培养结果:细胞贴壁生长,呈短梭状或棱形,经诱导培养后细胞充脂率高。经形态学观察、生长曲线及油红O脂肪染色法鉴定,证明是肌内前体脂肪细胞。普通PCR及实时荧光定量PCR均检测到了脂联素基因的表达。本研究通过差速贴壁法成功培养了猪肌内前体脂肪细胞,并通过诱导培养重现了其分化、成熟的全过程。 相似文献
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腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),在真核细胞生物中广泛存在,是调控机体能量代谢的关键酶.本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)AMPKα基因的有效siRNA干扰载体,并探讨AMPKα基因对脂肪分解关键酶基因表达的影响.根据猪AMPKα基因(GenBank登录号:NM-001167633)全长cDNA序列,设计合成其特异性发夹siR-NA干扰片段,将其克隆插入pSilencer 4.1-CMV neo Vector干扰载体中,构建猪AMPKα基因的siRNA真核表达载体RA1和RA2,并通过PCR、双酶切和测序对其进行鉴定.构建成功后转染猪肌内脂肪前体细胞并检测其干扰效果及对脂肪分解关键酶一一激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase,CPTl)基因表达的影响.结果表明,所构建的猪AMPKα基因的特异性siRNA表达载体RA1和RA2均可降低猪AMPKα mRNA表达(P＜0.05),而且RA2干扰效果优于RA1.用RA2干扰AMPKα后,猪肌内脂肪前体细胞中AMPKα及脂肪分解关键酶HSL、ATGL和CPT1基因表达量显著下降(P＜0.05).提示,抑制AMPKα基因表达后,猪肌内脂肪前体细胞中脂肪分解和脂肪酸氧化速率降低.本研究结果为深入探讨AMPKα对猪脂肪代谢的影响机制及通过营养调控基因表达进而调控猪体脂沉积提供基础资料. 相似文献
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ATGL是一种新发现的甘油三酯分解酶。根据猪ATGL基因全长cDNA序列,设计合成其特异性RNA干扰片段,将其克隆入pSilencer 4.1-CMV neo干扰载体中,构建猪ATGL基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并对其进行PCR、双酶切及测序鉴定。结果表明,成功构建了猪ATGL基因的特异性siRNA表达载体。这为进一步利用RNAi技术研究猪ATGL基因在脂肪代谢中的功能奠定了基础。 相似文献
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金华猪和长白猪背最长肌不同肌纤维类型表达差异 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示国内外猪种肌纤维组成差异及其对肉质的影响,本实验以肉质优良的地方品种金华猪和肉质欠佳的外来良种长白猪为研究对象,在比较了180 d两猪种胴体性能及肉质差异的基础上,利用荧光定量PCR方法探讨了两猪种背最长肌4种肌球蛋白重链(MyHC)亚型基因(Ⅰ、ⅡA、ⅡX、ⅡB)mR NA表达量在30、90、150、180 d的差异。结果表明:180 d金华猪活体重、瘦肉率、眼肌面积、滴水损失极显著低于长白猪(P<0.01);背膘厚、肌内脂肪含量极显著高于长白猪(P<0.01)。金华猪背最长肌中含有更多的氧化型肌纤维,特别是Ⅰ型肌纤维,酵解型肌纤维特别是ⅡB型肌纤维含量极显著地低于长白猪(P<0.01)。本研究初步揭示了两猪种在生长发育过程中肌纤维组成的品种差异,为进一步通过营养调控肌纤维类型及组成,进而改善肉质提供基础数据。 相似文献
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试验旨在研究饲粮中添加猫须草对猫采食、饮水及机体抗氧化和炎性指标的影响。选择24只健康成年宠物猫,根据体重平均分为4组,每组6个重复（公猫2只,母猫4只）,分别在基础日粮中添加0（对照组）、0.5%、1.0%、2.0%的猫须草。适应期7 d,正试期42 d。结果显示：饲粮中添加猫须草对猫体重、平均日采食量和养分消化率无显著影响（P>0.05）。与对照组相比,0.5%、1.0%、2.0%猫须草组第5、6周平均日饮水量显著提高（P<0.05）,血清丙二醛含量显著降低（P<0.05）;0.5%和1.0%猫须草组血清总超氧化物歧化酶活性显著提高（P<0.05）;1.0%猫须草组血清白细胞介素-6水平显著降低（P<0.05）。综上所述,猫粮中添加猫须草可促进猫的饮水,改善机体抗氧化和抗炎能力,提示猫须草有增加猫排尿量、减少泌尿系统疾病的潜在作用,添加量为1.0%时饲喂效果较好。 相似文献
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本实验旨在对猪新基因FAM134B基因进行全长克隆,尝试有效沉默FAM134B基因的干扰表达载体的构建和筛选,并筛选出沉默FAM134B基因的稳定阳性细胞。设计合成3对FAM134B基因的特异性发夹siRNA干扰片段,将其克隆入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默FAM134B基因的siRNA表达载体FAM134B-1、FAM134B-2和FAM134B-3,采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染肌内前体脂肪细胞,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果,并进一步用G418进行了稳定转染siRNA的肌内前体脂肪细胞筛选。结果表明:FAM134B基因的全长克隆成功,其siRNA表达载体构建正确,通过稳定筛选后,干扰效率较高的FAM134B-3表达载体和稳定转染FAM134B-3的细胞为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞,干扰效率达65.0%。本研究成功克隆了新基因FAM134B的全长以及构建了有效沉默FAM134B基因表达的干扰载体,并筛选出了稳定沉默的阳性肌内前体脂肪细胞,为进一步研究FAM134B基因在脂肪沉积中的功能研究奠定了基础。 相似文献