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本研究旨在建立一种基于RT-PCR的焦磷酸测序方法,以便对猪流行性腹泻(PED)进行高效准确地检测。利用PSQ Assay Design SW软件分析了猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因的保守区域,设计了一对扩增引物及一条测序引物,建立了PEDV N蛋白基因的焦磷酸测序检测方法。实验结果表明,该方法可以直接通过PSQ的序列结果直观地判定PEDV,大大提高了PEDV的检出率和准确性。该方法特异性强,不与其他猪源病毒发生交叉反应,最低核酸检测限为0.05 pg/μL。本研究所建立的焦磷酸测序方法灵敏度高、稳定性好,能从基因序列水平上精确鉴定PEDV,避免了假阳性结果的出现,对于PED的快速确诊具有重要意义。 相似文献
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利用基因克隆和体外转录技术,制备A型禽流感病毒通用核酸检测阳性标准样品。根据禽流感基质蛋白基因M的序列,设计全长开放阅读框的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品,初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准样品候选物。采用实时荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验,并委托外部实验室采用外标实时定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线和协作标定的方式,计算标准物质含量（拷贝）,并进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20~25℃（相对湿度20%~50%）14d,2~8℃3个月以及-20℃保存1年的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为（3.120±0.345）×10^8拷贝数,可用作禽流感病毒通用核酸检测的标准质控品。 相似文献
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金黄色葡萄球菌聚集因子A蛋白的原核表达及抗血清活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用PCR方法对金黄色葡萄球菌山东分离株ZFB1的聚集因子A(Clumping factor A,ClfA)基因进行扩增,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中获得重组克隆pGEX/ClfA,使ClfA与GST进行融合表达,然后利用原核表达的蛋白免疫小鼠制备抗血清,并采用黏附与黏附抑制试验对抗血清的活性进行分析。在SDS-PAGE和Western-blot试验中,表达产物相对分子质量(约67 000)同预期结果相符,与兔源抗ZFB1全价血清有特异的抗体结合活性。在黏附与黏附抑制试验中发现ClfA抗体能够抑制金黄色葡萄球菌在细胞表面的黏附。结果表明,ClfA可以作为保护性抗原,有助于动物抵抗金黄色葡萄球菌的侵入、定植和感染,从而为奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎的防治提供了科学的试验依据。 相似文献
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PRRSV SD-TA变异毒株的分离及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从猪"高热病"病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV N蛋白单克隆抗体所识别.根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较.结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3 %～99.1 %,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9 %.遗传关系表明:SD-TA株属于高致病性变异株. 相似文献
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根据GenBank上公布的犬腺病毒I型（CAV-I）E3基因序列,设计了3对特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,以CAV-I DNA为模板,通过条件优化建立了犬传染性肝炎LAMP快速检测方法,该方法能够在63℃恒温下30min内实现目的核酸的大量扩增,在可见光下即可直接观察扩增产物荧光颜色变化来判定结果。特异性和灵敏度试验表明,该LAMP检测方法只对CAV-I有特异性扩增,对其他无关核酸无扩增。与常规PCR检测相比,LAMP的检测灵敏度较好,最低检出限为10-7TCID50,是PCR检测方法的100倍。临床样品检测结果表明, LAMP阳性检出率为36%,与病毒分离鉴定的结果符合率达96.8%,与PCR检测的结果符合率达100%,且快速简便,成本低,适用于基层实验室的快速疾病诊断。 相似文献
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参照聚集因子A(Clumping factor A,ClfA)和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分别设计引物进行扩增,将ClfA基因和BoIL-18基因分别插入到真核双表达载体pBUDCE4.1的CMV和EF-1α2个启动子的下游,构建携带2个目的基因的重组真核双表达载体pBUDCE/ClfA/BoIL-18。在Cellfectin Reagent的作用下转染293T细胞,用间接免疫荧光试验检测ClfA和BoIl-18蛋白。结果表明,重组质粒pBUDCE/ClfA/BoIL-18在293T细胞中同时表达了ClfA和BoIL-18蛋白。该重组载体的成功构建为研究ClfA和BoIL-18重组共表达产物的生物学活性及其防治奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用奠定基础。 相似文献
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为了获得能够用于猪传染性胃肠炎(TGE)鉴别诊断的抗原蛋白,本研究以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)山东分离株SD-LY6核衣壳蛋白(N)基因为研究对象,对其进行引物设计并进行RT-PCR扩增,经克隆测序后对N蛋白基因序列进行分析;同时对N蛋白基因进行克隆,构建重组质粒pET-15b-TGEV-N,并进行IPTG诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。研究表明,TGEV SD-LY6株N蛋白基因序列高度保守,核苷酸以及氨基酸序列同源性均在97. 0%以上;获得了大小约为47 ku的纯化重组N蛋白,该重组N蛋白可以与猪传染性胃肠炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性,与无关血清样本无交叉反应,可以作为TGE的诊断抗原,为下一步高效快速诊断方法的研究提供坚实的基础。 相似文献
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以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因和山羊白介素18(gIL-18)基因,分别插入到双表达载体的P10启动子和多角体蛋白启动子PH的下游,构建重组质粒pFastBacTMDual-gIL18-VP1,然后转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18-VP1,并利用昆虫细胞进行转染。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明gIL-18基因和VP1基因同时在同一细胞中独立表达。将共表达产物进行生物学活性分析表明,重组蛋白能够诱导山羊脾淋巴细胞生成IFN-γ抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上生长。本试验用Bac-to-Bac系统成功构建了同时含有gIL-18基因和VP1基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达,且具有良好的生物学活性,从而为下一步研究gIL-18在口蹄疫(FMD)中的免疫调节作用奠定了坚实的基础。 相似文献