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利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。 相似文献
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为确定山东大学趵突泉校区内1只皮肤表面有多个明显痘疹的野生斑鸠的病原体,采集该斑鸠的皮肤痘痂,将其研磨液分别接种于鸡胚绒毛尿囊膜和鸡胚成纤维细胞（CEF）及幼仓鼠肾细胞21(BHK-21)中,均出现明显病变,分离到1株病毒,命名为斑鸠痘病毒-2018(TDPV-2018);对其核心基因部分片段进行扩增,得到3条特异性条带;对扩增产物进行测序分析。结果显示,该毒株在进化分型上归属于禽痘病毒的B分支,与来自英国的燕八哥身上所分离的禽痘病毒亲缘关系最近。可以初步判定感染该斑鸠的主要病原体为1株新的禽痘病毒。本研究为禽痘病毒的防控及致病机理的深入研究奠定了理论基础。 相似文献
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为了解我国野生动物源细小病毒VP2、NS1基因序列和进化特点,用PCR方法获得貉源细小病毒CR86106和猴源细小病毒BJ-22的目的基因片段,对其核苷酸和氨基酸序列进行测定分析.结果显示CR86106和BJ-22细小病毒基因组长均为4 269 nt,其中NS1基因全长2 007 nt,共编码668个氨基酸;VP2基因全长1 755 nt,共编码584个氨基酸.CR86106 VP2蛋白除第300位氨基酸为脯氨酸(P)以外,其余关键氨基酸位点均与猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPLV)一致;BJ-22 VP2蛋白除第323位为天冬酰胺(N)、第564位为丝氨酸(S)以外,其余关键氨基酸位点均与FPLV一致.CR86106 NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.4％～ 99.3％,VP2是97.6％～99.7％;BJ-22 NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.5％～99.4％,VP2是98.1％～99.3％.种系发生分析结果显示,CR86106 VP2和NS1与FPLV亲缘关系较近;BJ-22NS1归到CPV分支,VP2归到FPLV分支且单独分在一支.结果表明,CR86106具有FPLV样细小病毒序列特征,BJ-22具有FPLV和CPV重组病毒特征,为猴源细小病毒的重组现象,研究结果同时也证实了基因重组在FPLV进化过程中起重要作用的推论. 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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为研究西方马脑炎病毒(WEEV)囊膜E2蛋白的免疫原性,本研究通过诱导重组菌pET30-E2/E.coliBL21表达E2蛋白,将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂乳化制备免疫原免疫小鼠,免疫剂量为50μg/只。二免后实验组小鼠体内CD4+/CD8+T细胞比例为3.38±0.19,细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度分别为195.7±14.5 pg/mL、248.2±16.2 pg/mL与315.8±13.3 pg/mL;三免后实验组小鼠淋巴细胞增殖指数(PI)检测结果显示:ConA刺激组为2.18±0.17,E2蛋白刺激组为1.56±0.15;其特异性抗体IgG效价为1∶640。以上实验组各项免疫指标均与对照组呈显著差异(p<0.05),表明E2蛋白能够刺激小鼠产生较强免疫反应,具有较强免疫原性。本研究为WEEV基因工程亚单位疫苗研制奠定了良好基础。 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示:实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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