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研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D450 nm值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。 相似文献
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本文以准格尔旗黑岱沟露天煤矿东排土场为研究对象,针对露天矿排土场特殊的土壤侵蚀特点,选择不同排弃年限的排土场边坡坡度比较一致的坡面,分别在排弃年限为当年(2009年)、4年(2006年-2009年)、10年(2000年-2009年)的排土场边坡上布设径流小区,在径流小区中设置自记雨量计,记录降雨过程,据此计算每一次降雨的降雨量、降雨历时、平均降雨强度、最大30min雨强、降雨侵蚀力等。测算各降雨条件下不同排弃年限的排土场边坡产生的径流量和产沙量,分析降雨特性与排土场边坡水力侵蚀的关系。 相似文献
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本研究旨在评价不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫攻毒保护效果。选择4周龄仔猪25头,随机分为5组,每组5头猪,分别免疫四种猪肺炎支原体灭活疫苗（即疫苗A组、疫苗B组、疫苗C组、疫苗D组）,E组为攻毒对照组,不做任何处理,在同等条件下隔离饲养。各疫苗按照对应的说明书进行免疫,免疫后第14、28天进行采血,检测支原体抗体水平,一免后28 d时,所有免疫组连同攻毒对照组,各气管注射猪肺炎支原体CJ株5 m L/头（含0.01 g肺组织毒）。攻毒后饲养观察28 d,对所有实验组动物进行观察临床症状。A组实验动物攻毒后未出现咳嗽、腹式呼吸等支原体临床症状,B-D组实验猪攻毒后偶尔出现轻微间隔性咳嗽,E组实验动物攻毒后出现连续性咳嗽,个别猪出现腹式呼吸等临床症状。攻毒后第28天进行病理剖检。结果表明,攻毒对照组猪4/5头出现典型猪肺炎支原体病变,在肺脏尖叶、心叶、膈叶前1/3部位以及中间叶,出现“肉样”或“胰样”实质样病变,界限明显。B～D组解剖后个别猪出现典型猪肺炎支原体病变,A组实验动物解剖后个别猪肺脏出现零星病变,剩余实验动物肺脏均未出现猪肺炎支原体病变。根据肺部病变较少率计算,A～D组病变... 相似文献
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